Transformación Bacteriana Procedimiento

Producción y preservación de células competentes
Método Cloruro de Calcio
Producción de células competentes
Pasos previamente preparados por la instructora: Se inoculó 100μL de un cultivo fresco de 10-15 horas en 20mL de Luria Broth. Se incubó a 37°C con movimiento durante 1-2 horas. Crecer las células hasta cuando la densidad óptica (OD 660nm) se encuentre entre 0.6 y 1.
Rápidamentese colocó las células en hielo.
Se centrifugaron las células durante 5minutos, a 4ºC y una velocidad de 2,000rpm. Se descartó el sobrenadante y se colocó rápidamente el tubo con las células en hielo.
Se suspendieron las células en 5mL 0.1M cloruro de calcio frío y estéril.
Se mantuvo el tubo con las células en hielo durante 40 minutos.
Se centrifugaron las células durante 5minutos, a4ºC y una velocidad de 2,000rpm, luego se descartó el sobrenadante y se colocó rápidamente el tubo con las células en hielo.
Se suspendieron las células en 1mL 0.1M cloruro de calcio frío y estéril.
Preservación de células (80ºC)
Se distribuyeron las células competentes del procedimiento anterior en microtubos, debidamente rotulados y en volúmenes de 85μL. Se mantuvieron siempre en hielo.Se añadió 15μL de glicerol estéril a cada tubo y se mezcló suavemente.
Los microtubos se colocaron en una gradilla de plástico y luego se transfirieron los mismos a un vaso de análisis con hielo seco y una solución de etanol.
Se transfirió inmediatamente la gradilla con las células al congelador con una temperatura no menor de -80ºC.
Se mantuvieron las células competentes a -80ºC hastael momento de ser transformadas
Nota: Este protocolo fue realizado con propósito de práctica de técnicas, por lo que las células no fueron utilizadas para las siguientes experimentaciones y fueron descartadas. De haber sido utilizadas estas células, se procede a preservar las mismas hasta el momento de ser transformadas. Las células competentes utilizadas en las experimentaciones posterioresfueron previamente preparadas por el personal técnico del laboratorio.
Transformación de bacterias usando pUC19
Transformación Bacteriana utilizando el método Choque de Calor
Se removieron las células competentes de E. coli ubicadas en el congelador a – 80 º C, y se colocaron las mismas en hielo. (Se permitió que se descongelaran en hielo antes de proceder al próximo paso).
Se añadió 100 μLde dichas células en microtubos estériles previamente rotulados.
Muestra 1 (para placa LB-AMP)
Muestra 2 (para LB-AMP)
Control 1 - No DNA (para LB-AMP)
Control 2 - Células competentes (para LB)
Se añadió DNA (pUC19) (1.0-2.0µg/ 100µL células) Dependiendo de calidad y [DNA].
Muestra 1- 0.6µL
Muestra 2- 1.0µL
Controles no llevan DNA
Se incubó en hielo por 30 minutos.
Seincubó por 45 segundos a 42ºC. (NO SE DEBIA AGITAR).
Se incubó en hielo por 2 minutos.
Se añadió 950 μL del medio de cultivo SOC (temperatura ambiente) a cada microtubo, se mezcló suavemente y se transfirió a un tubo estéril de cultivo de 15 mL.
Se colocaron los tubos de 15mL en la incubadora durante una hora a 37ºC y a 225 rpm.
Al culminar la hora, se diluyeron los cultivos añadiendo1000μL de SOC al tubo estéril de cultivo.
Se dispersó 500μL de la mezcla de células en placas debidamente rotuladas.
Se colocaron las placas en la incubadora a 37 º C durante la noche.
Se observaron y se anotaron los resultados. Las placas fueron guardadas en la nevera (3- 10°C) y se colocó una cinta de parafina alrededor para evitar contaminación. Algunas de las colonias se utilizaronen las siguientes experimentaciones.
Luego se calculó la Eficiencia de Transformación de la transformación realizada.
Nota: Este protocolo se realizó en dos ocasiones, debido a que por diferentes factores no se obtuvieron los resultados esperados. En la primera ocasión, los medios utilizados no fueron preparados adecuadamente por lo que se vieron afectados los resultados. En la segunda...