Transformación De E.Coli Con Adn (Ibmc)

Trabajo Práctico 3
Transformación de E.coli con ADN
plasmídico

Profesores:
* Pelisch, Federico
* Luzzani, Carlos
* Godoy Herz, Micaela

Alumnas: Grupo 8
* Cóceres, Araceli
* Lopez, Yamila
* Undery, Jacqueline
* Villa, Agostina

Introducción:
En 1928, Frederick Griffith trabajó con distintas cepas de Streptococcus pneumoniae, la sepa S que presenta unacápsula que las recubre y las hace letal para los ratones y la cepa R que no presenta la cápsula y no provoca la muerte en ratones. Griffith notó que cuando inactivaba por calor a la cepa S y luego la inyectaba en ratones, éstos vivían normalmente pero cuando mezclaba la cepa R y la S inactivada, los ratones igualmente morían. Esto lo llevó a creer que existía algo que hizo que la cepa R se convierta enS. Finalmente, en 1944 Avery, MacLeod y McCarty concluyeron el experimento tratando a los contenidos de la cepa S muertos con enzimas que degradan polisacáridos, lípidos, proteínas, RNA y DNA y sólo obtuvieron un resultado positivo (destruir el principio transformante) cuando se los trataba con DNasas. Así se concluyó que el DNA era el componente genético en las bacterias.
Hoy en día se conocenvarios mecanismos de intercambio de material genético en bacterias, pueden ser entre individuos de la misma especie e incluso entre distintas especies. Los más comunes son:
- transformación: adquisición de ADN desnudo proveniente del medio extracelular (en general –en la naturaleza- de bacterias muertas).la bacteria capaz de captar el adn debe ser competente, es decir, debe tener una seria decaracterísticas en la membrana (receptores de ADN, proteína trasportadoras, etc) que faciliten el ingreso del material genético foráneo se trata de un estado transitorio)
Existen dos tipos de competencias, la competencia natural: Ocurre en algunas bacterias, estas son capaces de incorporar de manera natural es decir, el ADN bajo condiciones de laboratorio; y además pueden ser capaces de hacerlo ensus respectivos ambientes naturales por lo tanto traen un conjunto de maquinaria genética específica para llevar el ADN a través de las membranas[] y la competencia inducida artificialmente: Esta no esta codificada en los genes celulares, sino que puede ser inducida por procedimientos en el laboratorio donde las células son convertidas en permeables de forma pasiva, a través de condiciones que noocurren en la naturaleza.
– conjugación: es la transferencia de DNA entre dos bacterias en contacto cercano compatibles (+ y -) a través de un pelo sexual o pilus tubular.
- transducción: el material genético es transferido entre bacterias a través de virus bacteriófagos.

Una vez dentro de la célula, el DNA puede ser degradado, incorporarse al cromosoma por recombinación o quedar como unelemento de replicación autónoma. Para que un plásmido sea reconocido como propio por las bacterias necesita un origen de replicación. Generalmente también se le incorporan genes que les brinden características adicionales que les permitan a las bacterias sobrevivir y crecer en medios selectivos, generando así bacterias competentes.
Este estado se puede inducir en el laboratorio. La técnicautilizada en el Trabajo Práctico consiste en crecer las células en un medio de cultivo, colectarlas durante la “fase log” y resuspenderlas en una solución fría conteniendo CaCl2 (método de Hanahan).

Objetivos:
Transformar E. coli con el plásmido purificado en el trabajo practico “extracción de DNA
plasmídico”.
Calcular la eficiencia de transformación del plásmido.
Desarrollo:
Se recibieron 3tubos eppendorf conteniendo 50µl de bacterias competentes cada uno (-bacterias competentes, explicado en la introducción-). Las bacterias fueron crecidas en un medio de LB líquido a 37ºC. El LB contiene: bacto-triptona 10 g (fuente de nigtrogeno); extracto de levadura 5g (fuente de carbono); NaCl 5g y H2o hasta completar 1 litro, esta preparación se esterilizo por autoclavado y las bacterias...