Transformacion celular

Introducción
La transformación genética consiste en la adición de DNA exógeno extraído de un cultivo donante dentro del genoma bacteriano, este DNA foráneo puede provenir de un plásmido, el cual le puede otorgar al huésped genes beneficiosos para su supervivencia y adaptación a nuevos ambientes. Esta transformación puede demostrarse utilizando genes de resistencia a ciertos compuestos químicoso antibióticos, contenidos en el vector en cuestión. (1)
El proceso de transformación comienza con la permeabilización de la pared celular de la bacteria a transformar, luego se inserta el vector por medio de un shock térmico o bien mediante estímulos eléctricos, y por último se debe cultivar la célula transformada con los nutrientes necesarios para su crecimiento y expresión de los genesnuevos adquiridos. (2)
En éste práctico, se trabajará con el plásmido pGLO, el cual contiene un gen de resistencia al antibiótico ampicilina y otro que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP), ésta última característica se expresa bajo luz UV y en presencia del inductor arabinosa en células transformadas.(2)
Para seleccionar las bacterias transformadas con éste vector, se realizansiembras en placas de petri que contengan ampicilina y se observará crecimiento de éstas. También se puede verificar la expresión de la proteína GFP por medio de cultivos en placas, donde una contenga el inductor arabinosa y la otra no, así las bacterias transformadas presentarán fluorescencia solamente en la primera placa. (2)

Objetivos

• Conocer el concepto de gen y la manipulación de éste deun vector a otro organismo.
• Comprender la técnica de transformación celular y su importancia en biotecnología.
• Comprender las características de los plásmidos.
• Transformar genéticamente la bacteria E. coli por inserción del plásmido pGLO para la adquisición de la característica fenotípica de resistencia a la ampicilina y monitoreo de la transformación a través de la expresión de laproteína verde fluorescente.
• Reproducir las condiciones de esterilidad necesarias para llevar a cabo la transformación bacteriana.


Materiales y Métodos.
El método, consiste en tomar 2 tubos Eppendorf que contienen CaCl2 y 50µL de E. coli, los que son rotulados como: DNA (-) y DNA (+). Mediante una micropipeta, y cercano al mechero (como medida de esterilidad) se agregan 5 mL de pGLO al tuboDNA (+) y se agita muy suavemente. Ambos tubos se mantienen en hielo durante 20 minutos, transcurrido el tiempo, se llevan a un baño de agua caliente a 42°C por 1 minuto, para producir el shock térmico, y se vuelven a poner en hielo por 2 minutos más. Posteriormente, a los dos tubos, se les agrega 500 µL de luriabertonia (medio de cultivo LB), y se mantienen a 37°C aproximadamente durante 25minutos. En paralelo, se rotulan las 4 placas entregadas de la siguiente manera:
Medio DNA
LB / AMP (+)
LB/AMP/ARA (+)
LB/AMP (-)
LB (-)

Por otra parte, con ayuda del rastrillo, se procede a sembrar las placas con DNA. La espátula de drigalsky es sumergida en alcohol y luego se flamea bajo el mechero, se agregan 100 µL desde los tubos Eppendorf rotulados, a las respectivas placas, con unmovimiento suave, procurando que la siembra quede homogénea, finalmente se incuba con el medio hacia arriba.

Discusión

DNA - / LB:

El medio de cultivo LB (Luria Bertoni) al contener extracto de levadura, triptona ,NaCl y un pH neutro , es uno de los medios utilizados por excelencia para el mantenimiento de las cepas de E.coli por lo que en estemedio se esperaba un optimo crecimiento de la bacteria en cuestión, resultado que se obtuvo de buena manera. Sin embargo, se observa la presencia de una colonia aislada, distinta en morfología al resto del césped, lo que sugiere la presencia de contaminación, su forma redondeada indica que probablemente se trate de una levadura, ya que en los medios de cultivo sólidos, las levaduras crecen dando...