transformacion de E.coli con plasmidos recombinantes

48. Transformación de Escherichia coli con un
plásmido recombinante


RESUMEN

Se trabaja el principio de adquisición de información genética en
bacterias mediante la introducción de DNA plasmídico por
transformación. Se trabaja la selección de clones celulares con las
características esperadas de la expresión o ausencia de expresión de los
genes marcadores presentes en un plásmidorecombinante y se estima la
eficiencia de la transformación. Asimismo, se preparan soluciones y
medios de cultivos de bacterias y se utilizan en condiciones asépticas.
Palabras clave: células competentes,
transformación, β-galactosidasa.

choque

térmico,

eficiencia

de

Abreviaturas empleadas. ATP: trifosfato de adenosina; DNA: ácido
desoxirribonucleico; mRNA: ácido ribonucleicomensajero; IPTG, isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La transformación es un proceso por el cual las células captan DNA libre
presente en el medio. Es un fenómeno que ocurre de forma natural en muchas
bacterias, pero la eficacia del proceso varía enormemente de unas especies a
otras. Para que la transformacióntenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse
en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones
fisiológicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y
membrana celulares, que permiten la entrada de ácidos nucleicos en la célula.
En el laboratorio se ha conseguido poner a punto técnicas que inducen el
estado de competencia en bacterias que no lopresentan de forma natural,
como es el caso de E. coli. Estas técnicas se basan en diversos tratamientos
químicos o físicos que producen microporos en la célula, lo que permite la
introducción del DNA exógeno (transformación) de modo bastante eficiente.
Uno de los métodos físicos es la electroporación, consistente en inducir la
competencia mediante la aplicación de un pulso eléctrico muy brevee intenso.
Dicha competencia se puede inducir con tratamientos químicos utilizando
compuestos como el cloruro cálcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que
tras estos tratamientos no todas las células del cultivo se hacen competentes.

1

La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de enorme
utilidad, que nos permite introducir prácticamente cualquier plásmido en suforma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El método
que se describe a continuación es, por su simplicidad, uno de los más
utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformación, el DNA
introducido llevará un marcador seleccionable en el medio adecuado.

El objetivo de esta práctica es introducir el plásmido recombinante obtenido
en una reacción deligación en la estirpe de Escherichia coli DH5α. Esta estirpe
está modificada genéticamente de manera que es posible inducir en laboratorio
la competencia de las células así como mantener el plásmido de forma estable
en su interior.
Se usarán células competentes obtenidas por tratamiento químico con
cloruro de calcio.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
Tubos Eppendorf, micropipetas, puntasestériles, agua estéril, microcentrífuga,
baño termostatizado.

3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Obtención de células competentes
1. Estriar las células de Escherichia coli DH5α en una caja Petri con medio
PSI-a e incubar toda la noche a 37ºC.
2. Inocular 5 ml de medio PSI-b con una colonia aislada (utilizar un matraz
de 125 ml) e incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad óptica de 0,3 a
550 nm.3. Inocular, con el cultivo anterior, 100 ml de medio PSI-b en un matraz de
1 litro precalentado a 37ºC. Incubar a 37ºC hasta alcanzar una densidad
óptica de 0,48 a 550 nm.
4. Enfriar el matraz del paso anterior durante 5 minutos en hielo y
posteriormente recoger las células por centrifugación a 6000 rpm, 5
minutos a 4ºC.
5. Resuspender el pella (“pellet”) en 40 ml de TFB-1 frío....