Transformacion DH5
Páginas: 7 (1600 palabras)
Publicado: 24 de octubre de 2013
Transformación de bacterias E. coli
Para poder introducir DNA foráneo con alta eficiencia dentro de bacterias es necesario inducir el “estado de competencia” de las mismas. El tratamiento de cultivos bacterianos frescos, en fase logarítmica de crecimiento, con agentes quimicos permite debilitar la estructura de su pared celular haciendo que se puedan introducir en las células DNAs derivadosde distintas fuentes. Un requisito fundamental es que la manipulación de las bacterias durante el tratamiento químico, y después del mismo, sea muy cuidadosa, ya que al tener alterada la pared aumenta el grado de fragilidad de las bacterias.
Una alternativa al tratamiento químico es la electroporación, en este caso se somete a las bacterias a un campo eléctrico que desestabiliza a las estructuasde pared y membrana. Durante este proceso se inducen poros temporarios por los que ingresa el DNA en las bacterias. En este caso no es necesario inducir el “estado de competencia” previamente, simplemente las bacterias de un cultivo en fase logarítmica de crecimiento se lavan varias veces para eliminar todas las sales que puedan estar presentes.
Preparación de bacterias E.coli DH5 competentesa) Crecer un cultivo de E. coli a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) en medio LB hasta alcanzar saturación (overnight).
b) Diluir el inóculo al 1% medio, crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) hasta alcanzar una OD600 de 0,8 a 1 (fase logarítmica tardía).
c) Incubar las bacterias durante 5 minutos en agua- hielo.
d) Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4C.
e)Resuspender el pellet en 40 ml de TFBI a 0C.
f) Incubar la suspensión durante 5 minutos en agua- hielo.
g) Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4C.
h) Resuspender el total del pellet en 4 ml de TFBII.
i) Incubar las bacterias durante 15 minutos en baño de agua- hielo.
j) Fraccionar en tubos Eppendorf en alícuotas de 500 l.
k) Conservar a -80C hasta su utilización.
Medio LB:disolver 10 gr de triptona, 10 gr de NaCl y 5 gr de extracto de levadura en un litro de agua bidestilada. Para preparar medio sólido incorporar 15 gr de agar por litro de medio.
TFBI TFBII
Acetato de K 30mM Pipes o Mops 10mM
KCl 100mM CaCl2 75mM
CaCl2 10mM KCl 10mM
MnCl2 50mM glicerol 15%
Glicerol 15%
Preparación de bacterias E.coli DH5 competentes
a) Crecer un cultivo de E. coli a37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) en medio LB hasta alcanzar saturación (overnight).
b) Diluir el inóculo al 1% medio, crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) hasta alcanzar una OD600 de 0,5 a 0,6 (fase logarítmica tardía).
c) Incubar las bacterias durante 10 a 15 minutos en agua- hielo.
d) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
e) Resuspender cuidadosamente el pelleten 100 ml de CaCl2 100mM.
f) Incubar la suspensión durante 30 minutos en agua- hielo.
g) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
h) Resuspender cuidadosamente el pellet en 100 ml de MgCl2 100mM.
i) Incubar 30 minutos en baño de agua- hielo.
j) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
k) Resuspender cuidadosamente el pellet en 1 ml de solución de CaCl2 100mM, MgCl2 100mM y30% de glicerol.
l) Fraccionar en alícuotas de 50 a 100 l en tubos Eppendorf.
m) Conservar a -80C hasta su utilización.
Preparación de bacterias E.coli DH5 electrocompetentes
a) Inocular 1 litro de medio LB (sin NaCl) con 10 ml de un cultivo fresco saturado (cultivo overnigth) para lograr una dilución 1/100 del cultivo original.
b) Crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm)hasta alcanzar una OD600:0.5
c) Colocar el cultivo en hielo durante 15’ a 30’ .
d) Distribuir 200 ml de cultivo en 5 ”mamaderas” de 250 ml de capacidad.
e) Centrifugar en rotor GSA (previamente enfriado) a 4000 rpm durante 10’.
f) Remover todo el sobrenadante (lo mejor posible). Resuspender el total del pellet en 1000 ml de glicerol* al 10% (200 ml en cada ”mamadera”).
g) Centrifugar a 4000...
Para poder introducir DNA foráneo con alta eficiencia dentro de bacterias es necesario inducir el “estado de competencia” de las mismas. El tratamiento de cultivos bacterianos frescos, en fase logarítmica de crecimiento, con agentes quimicos permite debilitar la estructura de su pared celular haciendo que se puedan introducir en las células DNAs derivadosde distintas fuentes. Un requisito fundamental es que la manipulación de las bacterias durante el tratamiento químico, y después del mismo, sea muy cuidadosa, ya que al tener alterada la pared aumenta el grado de fragilidad de las bacterias.
Una alternativa al tratamiento químico es la electroporación, en este caso se somete a las bacterias a un campo eléctrico que desestabiliza a las estructuasde pared y membrana. Durante este proceso se inducen poros temporarios por los que ingresa el DNA en las bacterias. En este caso no es necesario inducir el “estado de competencia” previamente, simplemente las bacterias de un cultivo en fase logarítmica de crecimiento se lavan varias veces para eliminar todas las sales que puedan estar presentes.
Preparación de bacterias E.coli DH5 competentesa) Crecer un cultivo de E. coli a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) en medio LB hasta alcanzar saturación (overnight).
b) Diluir el inóculo al 1% medio, crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) hasta alcanzar una OD600 de 0,8 a 1 (fase logarítmica tardía).
c) Incubar las bacterias durante 5 minutos en agua- hielo.
d) Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4C.
e)Resuspender el pellet en 40 ml de TFBI a 0C.
f) Incubar la suspensión durante 5 minutos en agua- hielo.
g) Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4C.
h) Resuspender el total del pellet en 4 ml de TFBII.
i) Incubar las bacterias durante 15 minutos en baño de agua- hielo.
j) Fraccionar en tubos Eppendorf en alícuotas de 500 l.
k) Conservar a -80C hasta su utilización.
Medio LB:disolver 10 gr de triptona, 10 gr de NaCl y 5 gr de extracto de levadura en un litro de agua bidestilada. Para preparar medio sólido incorporar 15 gr de agar por litro de medio.
TFBI TFBII
Acetato de K 30mM Pipes o Mops 10mM
KCl 100mM CaCl2 75mM
CaCl2 10mM KCl 10mM
MnCl2 50mM glicerol 15%
Glicerol 15%
Preparación de bacterias E.coli DH5 competentes
a) Crecer un cultivo de E. coli a37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) en medio LB hasta alcanzar saturación (overnight).
b) Diluir el inóculo al 1% medio, crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm) hasta alcanzar una OD600 de 0,5 a 0,6 (fase logarítmica tardía).
c) Incubar las bacterias durante 10 a 15 minutos en agua- hielo.
d) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
e) Resuspender cuidadosamente el pelleten 100 ml de CaCl2 100mM.
f) Incubar la suspensión durante 30 minutos en agua- hielo.
g) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
h) Resuspender cuidadosamente el pellet en 100 ml de MgCl2 100mM.
i) Incubar 30 minutos en baño de agua- hielo.
j) Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos a 4C.
k) Resuspender cuidadosamente el pellet en 1 ml de solución de CaCl2 100mM, MgCl2 100mM y30% de glicerol.
l) Fraccionar en alícuotas de 50 a 100 l en tubos Eppendorf.
m) Conservar a -80C hasta su utilización.
Preparación de bacterias E.coli DH5 electrocompetentes
a) Inocular 1 litro de medio LB (sin NaCl) con 10 ml de un cultivo fresco saturado (cultivo overnigth) para lograr una dilución 1/100 del cultivo original.
b) Crecer a 37C con agitación vigorosa (190-200 rpm)hasta alcanzar una OD600:0.5
c) Colocar el cultivo en hielo durante 15’ a 30’ .
d) Distribuir 200 ml de cultivo en 5 ”mamaderas” de 250 ml de capacidad.
e) Centrifugar en rotor GSA (previamente enfriado) a 4000 rpm durante 10’.
f) Remover todo el sobrenadante (lo mejor posible). Resuspender el total del pellet en 1000 ml de glicerol* al 10% (200 ml en cada ”mamadera”).
g) Centrifugar a 4000...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.