Transformacion e. coli bl21de3 con plasmidio pglo

Universidad de las Américas

Biología Molecular

Extracción y cuantificación de DNA y preparación de células competentes para expresión de plásmido Pglo. en células de Escherichia coli bl21 (DE3).
Barría, Jazmín (1) Verdugo, Sebastián (2)
Universidad de las Américas, Facultad de medicina veterinaria y agronomía escuela de agronomía (1) Facultad de Ingeniería, escuela de bioingeniería eingeniería ambiental (2) Santiago, región metropolitana, Chile Junio-2011.

Resumen Dentro de la información contenida en este informe el lector podrá encontrar el procedimiento a seguir para poder expresar el gen del plásmido Pglo en células de Escherichia coli BL21 (DE3). Este proceso se realiza en 4 etapas de laboratorio, las que se describen más adelante. El resultado se observo con células deEscherichia coli BL21 (DE3) clonadas que expresaron el gen del plásmido Pglo con un color verde fluorescente, vistas a luz UV.

Palabras clave: Escherichia coli BL21 (DE3), Clonación, plásmido Pglo, Electroforesis.

1. Introducción
El siguiente texto contiene las experiencias realizadas en laboratorio con el fin de detallar los pasos que se siguieron, a demás de las soluciones y las técnicasutilizadas para la elaboración de cada unos de los prácticos que se detallan a continuación.

25mM TRIS7/ HCl a pH 8.0 10mM EDTA a pH8.0. Solución en 100ml total. Solución 2 0,2 M NaOH 1 % p/v SDS Solución 100 ml total Solución 3 60 ml de solución de acetato de sodio 5M. 11.5 ml de ácido acético. 28.5 ml de agua destilada. Para llevar a cabo el procedimiento se toman 2 ml del medio de cultivo yse centrifuga a 3000 rpm ¹ durante 5 min, posteriormente se extrae el sobrenadante y se deja el pellet o precipitado con

2. Materiales y métodos.
2.1 Extracción y purificación de ADN plásmidal. Para la extracción de ADN plásmidal se realizaron 3 soluciones: Solución 1 50mM glucosa

Universidad de las Américas bacterias, al que se le agregan 300 µl de la solución 1 para que se produzca unaresuspensión luego se agregan 300 µl de la solución 2, la cual, realiza la lisis, el NaOH presente en la solución rompe la pared celular y el detergente SDS sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución, el detergente también inhibe cualquier actividad nucleasas presente en la preparación (Karp. 1996). Y por ultimo se agregan 300 µl de lasolución 3, la cual, provoca la precipitación de proteínas y del DNA cromosómico. El producto de lo anterior se incuba en hielo durante 5 minutos. Con esto se obtiene el DNA plasmidial, a este, se le agrega 1 ml de etanol al 100%, se agita e incuba durante 5 min. a temperatura ambiente, se centrifuga nuevamente a 3000 rpm1 durante 5 min. Para precipitar el DNA plasmidal, nuevamente se extrae elsobrenadante, el Pellet que se obtiene con DNA plasmidal se lava con 500 µl de etanol al 70 %, se agita y centrifuga a 3000 rpm ¹ durante 5 min. El sobrenadante se elimina y el pellet se resuspende en 40 µl de agua destilada. 2.2 Electroforesis y cuantificación de DNA. De las diferentes técnicas empleadas para fraccionar proteínas, la electroforesis en gel es utilizada ampliamente en la separaciónde ácidos nucleicos, las moléculas de RNA y DNA pequeñas, de pocos cientos de nucleótidos o menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (Karp. 1996), para esta técnica se utiliza este tipo de matriz tipo gel, que es un material poroso inerte similar a la gelatina. Como las moléculas de DNA tienen carga negativa, cuando se someten a un campo eléctrico migran através del gel hacia el polo positivo (fig. 1) (Watson, 2005).

Biología Molecular Este gel de electroforesis compuesto de agarosa al 0,8%, es corrido mediante un buffer TAE 1x, en el se depositan las distintas muestras de estudio, las que se comparan con una muestra de tamaño molecular λ HIND III, la cual, contiene 8 fragmentos de DNA de tamaño discreto del fago lambda completamente digerido...