Transformacion y clonamiento

Introducción

En este experimento se aprenderá el procediendo de transformación genética y clonación de ADN con vectores plásmidos; para poder utilizar este procedimiento se utilizara el plásmido Pglo.
La transformación genética se divide en tres etapas esenciales:

1.- permeabilizar la paredes celular para posibilitar el ingreso del vector plasmidial
2.- introducir el vector anteriormentemencionado por un proceso denominado shock térmico
3.-suministrar nutriente a las bacterias transformadas para expresar los genes adquiridos.
El plásmido Pglo, es un plásmido es un gen que codifica para una proteína fluorescente verde, se encuentra en las medusas de nombre científico Aequorea victoria. Esto provoca que la medusa florezca y brille en zonas profundas donde solo alcanza los rayosUV.
El otro procedimiento utilizado en este laboratorio fue el de clonación de ADN con vectores plásmido, para que la clonación comience se necesitan de las siguientes enzimas
1.- nucleasas o enzimas de restricción: encargadas de cortar el ADN en secuencias específicas de nos pocos nucleótidos para generar pequeños fragmentos de estos.
2.-ADN ligasa permiten unir los fragmentos de ADN derestricción en (*) vectores permitiendo su replicación es decir producir ADN recombinarte.
(*) Vectores de clonación: son los plasmados y el bacteriófago alfa de E.coli. Utilizados mas frecuentemente en la técnica de ADN recombinante.
Estos vectores tienen las siguientes secuencias:

1.- origen de replicación
2.- gen de resistencia a antibiótico
3.- región donde se insertar los fragmentos de ADNexógeno (sitio de múltiple clonamiento)
Ahora que ya se a resumido la información principal para entender este laboratorio solo nos falta hacer nos las siguientes preguntas; ¿Se podrá aplicar impecablemente la técnica de transformación genético? ¿Serán muy frecuentes los errores en estos procedimientos?

Objetivos

• Aprender a utilizar la técnica de transformación genética

•Conocer más sobre la acción de los vectores

• Aprender la técnica de clonación de ADN con vectores plasmados

• Aplicar la técnica de placar explicado por los profesores

Materiales y Método

Este experimento se comenzó por esterilizar la mesa de trabajo con etanol, una vez ya esterilizado el lugar de trabajo, se marcaron dos tubos con el nombre del grupo los cuales contenían lasbacterias necesarias para realizar este laboratorio estas eran ADN+ y ADN-, una vez ya listos los tubos se pusieron sobre hielo en un soporte de hule espuma.
Al tubo de bacterias ADN+ se le agrego 10 ul de plásmido pGLO y se revolvió cuidadosamente con una pipeta. Ya listo este procedimiento se mantuvieron ambos tubos en el soporte de hule espuma sobre hielo.
Al mismo tiempo que semantienen los tubos en el hielo se marcaron cuatros placas de petri por la parte de abajo con las siguientes siglas:
• LB/AMP; +ADN
• LB/AMP/ARA: +ADN
• LB/AMP:-ADN
• LB;-ADN
Los tubos anteriormente mencionados en flotadores de espuma fueron colocados a baño maría a 42º C por 50 segundos exactos, pasado los 50 segundos se transfirieronrápidamente los tubos al hielo por 2 minutos, después de estos dos minutos con una pipeta esterilizada se agrego 250ul de medio cultivo a cada unos de los tubos anteriormente mencionados posteriormente a este procedimiento los tubos fueron cerrados manteniéndolos a temperatura ambiente por 30 minutos.
Terminado el paso anterior se utilizo una pipeta esterilizada para cada uno de los tubos, fueronpipeteados 100ul de la suspensión de transformación a cada placa petri correspondiente. Con un asa estéril para cada placa fueron deslizadas en la suspensión y en la superficie del agar.
Ya terminado todos los pasos se apilaron las placas de agar con el nombre del grupo correspondiente colocándolos a 37º C hasta la semana siguiente.

Resultados

( Resultados con GFP
y
control...