Transformación bacteriana





“Transformación
Bacteriana”

Guía 10: Practico de transformación
















Introducción

El DNA contiene el material génico de todo organismo, y este material se organiza por genes, los cuales al ser leídos se traducen a proteínas, que otorgan una nueva característica al organismo. Gracias a estos genes, se puede realizar un método artificial denominadotransformación, en el cual se insertan genes de un organismo a otro, con el fin de otorgarle nuevas características al receptor. [1]

Existen organismos que son capaces de trasladar genes de forma natural, como lo hacen las bacterias. Estas pueden transferirle fragmentos de DNA a una bacteria receptora, proceso denominado "Conjugación Bacteriana". En bacterias existen DNA foráneos (no son propios dela bacteria), que son circulares de doble hebra, los cuales se denominan "plásmidos" y en el proceso de conjugación este es el DNA que con mayor frecuencia es compartido. Los plásmidos contienen secuencias de adaptación de las bacterias, como por ejemplo la resistencia a antibióticos, nuevas víasmetabólicas, entre otras características [2].En el métodoartificial de transformación bacteriana setrata de "imitar" el proceso de conjugación, empleando vectores plasmídicos especializados, que ademáspueden clonarse[1.a].

En este practico transformaremos bacterias a partir de un gen que codifica para la síntesis de la proteína fluorescente verde (GFP) la cual originalmente se produce por la medusa bioluminicente "Aquorea victoria". Luego de insertar el gen en bacterias de E. coli se esperaraque esta produzca GFP, que las hará brillar verde bajo la luz UV.

El plásmidopGLO contiene genes que codifican para la GFP además de otro gen que otorga resistencia al antibiótico ampicilina. Este vector incorporara un sistema de regulación de la expresión de la proteína. Entonces, en las bacterias transformadas, el gen se puede "encender" agregando arabinosa al medio de cultivo.
Paraasegurarnos de tener un 100% de bacterias transformadas, las someteremos a ampicilina, por lo tanto las bacterias resultantes en la placa serán las que contendrán el plásmido con el gen (gen+resistencia a ampicilina), ya que las demás bacterias del cultivo habrán muerto porque no fueron transformadas, es decir, no incorporaron el plásmido, por lo tanto no resistieron la ampicilina.







OBJETIVOGENERAL: 

Realizar una transformación bacteriana.

OBJETIVO PRINCIPAL:

Generar bacterias resistentes a ampicilina y que puedanfluorecer a través de la luz UV.
Comprender la importancia de un shock térmico para obtener una bacteria resistente al antibiótico ampicilina y fluorescente.






























METODOLOGIA:

1. Se debe etiquetar el tuboeppendorff con las siglas +pGLO y otro con siglas de –pGLO.
2. Con lamicropipeta se debe agregar  250 µl de la solución de transformación (CaCl2).
3. Colocar los tubos en el hielo.
4. Se procederá a encender el mechero para poder mantener el asa estéril. Luego se extraerá la colonia de E.coli a partir de la placa madre.
5. Tome el tubo de +pGLO y  sumerge el asa en la solución detransformación.
6. Haga girar el asa para poder dispersar la colonia en  la solución de  transformación.
7. Coloque el tubo en el hielo. 
8. Repita el mismo el procedimiento anterior para el  el tubo de -pGLO.
9. Poner el asa en la solución del plásmido y luego mezclar SOLO en el tubo con +pGLO.
10. Incube los tubos nuevamente en hielo por 10 minutos. 
11. Mientras, etiquete sus placas de agar LB.Escribiendo lo siguiente:
a) LB/Amp +pGLO
b) LB/Amp Ara +pGLO
c) LB/Amp  -pGLO.
d) LB –pGLO.
12. Para producir un shock térmico, transfiera los tubos a un baño de agua a 42°C por exactamente 50 segundos.
13. Posteriormente coloque los tubos en hielo de forma rápida, durante 2 minutos aproximadamente.
14. Retire los tubos del hielo y colóquelos sobre el mesón. Con una micropipeta  agregar 250 µl...