Transformación celular

Introducción

En 1928 se desarrolló un experimento que en ese entonces sería de poca importancia, pero que revolucionaría el campo de la genética; Frederick Griffith, bacteriólogo, médico y genetista británico, en uno de sus intentos para desarrollar una vacuna capaz de contrarrestar a la Streptococcus pnumoniae, una bacteria que genera un tipo de neumonía, enfermedad muy grave en ese tiempo,descubrió lo que hoy se conoce como Transformación Genética. Griffith comenzó inyectando varias cepas de Streptococcus pnumoniae a ratones, vivas con cápsula de polisacáridos (causan enfermedad), vivas sin cápsula (inocuas), muertas por calor con cápsulas (es decir, inocuas) y combinación de muertas con cápsula con vivas inocuas, dando como resultado la muerte del ratón. Llegó a la conclusión deque las bacterias vivas inocuas habían adquirido las características de las muertas que producían la enfermedad (1), lo que llamó “Principio de Transformación” (2). A partir de aquí esta técnica se ha transformado en parte fundamental en la formación de vacunas, y en el estudio de bacterias y creación de antibióticos contra ellas, además del área de agricultura y medicina.
La transformacióngenética quiere decir el ingreso o inserción de genes ajenos a un organismo a éste, con el objetivo de cambiar o modificar este organismo (3). En éste práctico se intentará modificar bacterias (Eschechiria coli BL21) mediante el plásmido pGLO el cual contiene genes para la GFP (Green Fluorescent Protein), la cual da a la bacteria fluorescencia verde en presencia de luz UV extraído de una medusa (Aequoreavictoria), genes que le confieren resistencia a la ampicilina y además contiene un sistema de regulación de la expresión de la GFP (un promotor de operon arabinosa).

Objetivos

 Comprender la forma en la que las bacterias incorporan material genético exógeno en forma artificial
 Aprender a realizar de manera correcta un transformación bacteriana simple, respetando cada uno de los pasosdel procedimiento y la condición de esterilidad necesaria para trabajar con las bacterias
Método

Dispone de 100 μm de bacterias tratadas con Cacl2 , se esterilizo el lugar de trabajo y las manos con etanol y se encendió el mechero (con el objetivo de crear una “campana” de esterilidad), las bacteria se separaron en dos microtubos (50 μm y 50 μm en cada uno) marcando cada tubo; solo al primero sele agregaron 10 μm de plasmidio pGLO (todos los procedimientos en los que se interactuó directamente con las bacterias debieron ser realizados próximos a la “campana” de esterilidad, para evitar contaminación de la muestra). Luego ambos tubos tuvieron que ser colocados en hielo por 20 min. Después, se trasladaron a baño termorregulado a 42°C por 50 segundos exactos. Nuevamente debieron sercolocados en hielo, pero solo por 2 min. Pasados los 2 minutos a ambos tubos se les debió agregar 250 μm de LB (medio de nutrientes necesarios para las bacterias, Lysogeny Both o Luria Bertani) y se sacudieron cada uno en las manos de uno de nuestros integrantes (para tenerlos a temperatura de 37°C) por 30 min. con agitación (todos los agregados debieron hacerse por medio de diferentes puntas demicropipetas, para evitar contaminación).
Ahora, se debió esterilizar, mediante etanol y combustión de éste el asa de siembra (se baña la punta de éste en etanol, y luego se pone en contacto la parte que tiene etanol con la llama del mechero, produciéndose la combustión del etanol, acto seguido, la total esterilización. Para enfriarla se refregó la punta del asa contra la parte interior de la tapa de laplaca Petri que se estaba utilizando). Se tenían cuatro placas petri con distintos medios; el primero contenía LB, el segundo LB más ampicilina, el tercero lo mismo que el anterior, y el cuarto contenía LB, ampicilina y arabinosa. En la primera placa petri se debieron agregar 100 μm de las bacterias que sólo contenían LB (al agregarlas fueron esparcidas con el asa de siembra), a la segunda...