Transformación De Escherichia Coli Con Dna Plasmidíco

INTRODUCCIÓN

A LA

BIOLOGÍA MOLECULAR

Y

CELULAR







TRABAJO PRÁCTICO N° 3



TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli

CON DNA PLASMIDÍCO



















Introducción

Una transformación ocurre cuando una bacteria obtiene DNA desnudo del medio extracelular.

Objetivo

El objetivo del trabajo práctico es transformar Escherichia coli con elplásmido purificado obtenido en el trabajo práctico anterior (“Extracción de DNA plasmídico”).

Metodología

1. Se debió esterilizar el lugar de trabajo con alcohol al 70 % al igual que nuestras manos para obtener la ausencia total de microorganismo como pueden ser esporas, que compitan con nuestro plásmido por los nutrientes. También se deben realizar todos los pasos con un mechero encendido a unadistancia no mayor de los 20 cm.

2. Los 3 tubos eppendorf recibidos, con 50 µl de bacterias competentes c/u se encuentran en hielo; también se recibió un cuarto tubo con el plásmido control de concentración 0,5 µg/µl obtenido por los docentes y el tubo con el plásmido obtenido por nosotros en el trabajo práctico anterior.

3. Se diluyó nuestra muestra en 2/20 con 18 µl de aguadestilada para obtener una dilución de 1/100 de plásmido. Se mantienen todos los tubos en hielo y se los numera. Debido a que previamente al desarrollo de nuestro TP, en el laboratorio se indujo la competencia en células bacterianas para la introducción de plásmidos, es necesario manipularlas con cuidado. Este tratamiento previo de acuerdo al método Hanahan, consistió en la incubación en hielo del DNAplasmídico con las células competentes en solución de CaCl2, que servirá para que el Ca2+ neutralice las cargas negativas de los fosfatos de DNA y de los fosfolípidos de la membrana bacteriana, disminuyendo en consecuencia la repulsión natural de estas biomoléculas; esta solución también altera la estructura de la pared celular que en conjunto con la baja temperatura que disminuye la fluidez de lamembrana facilitará la entrada del DNA a las bacterias. Como segundo paso dentro de este tratamiento se efectuó un shock térmico pasando desde el hielo directamente a un baño de 42°C por un minuto y medio para lograr que se formen poros en la membrana plasmática de las bacterias y así pueda incorporarse el DNA plasmídico a las células. H2O

4. Se agregan a cada uno de los tubos lo que indica lasiguiente tabla:

|Tubo # |1 |2 |3 |
|H2O estéril |2 µl |- |- |
|Plásmido control |- |2 µl |- |
|Plásmido obtenido en el TP |- |- |2 µl |


5. Se los dejaen hielo durante 20 minutos.

6. Se colocan las 3 tubos a 42°C durante no más de 90”, es decir durante minuto y medio controlando rigurosamente el tiempo.

7. Se ponen los tubos en hielo con agua para que se enfríen rápidamente durante 5 minutos.

8. Se agregan 950 µl de LB líquido, que sirve como medio de cultivo, a cada uno de tubos numerados (1, 2 y 3), se homogeniza por inversióne incubar por 30 minutos a 37°C en baño termostático para lograr el mismo efecto de shock térmico explicado antes.

9. Transcurrido este tiempo se centrifugan las bacterias a 4500 rpm durante 10 minutos, se descarta el sobrenadante por volcado y se resuspende el pellet en el medio LB remanente.

10. Se plaquea la suspensión de bacterias, es decir se colocan 950 µl de la muestra debacterias en placas de petri que contienen LB sólido con ampicilina, en una medida de 100 µg/µl. También se plaquean 100 µl de los tubos 1, 2 y 3 en placas (también numeradas) de LB sin ampicilina que serán el control de viabilidad. También se toma un rastrillo que se bebe en alcohol y se lleva al fuego durante 5 segundos, se controla que no esté a mucha temperatura para evitar romper el LB, y se...