Transporte De Glucosa En Levaduras

Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de Microbiología

Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Laboratorio de Fisiología y Bioquímica Microbiana

Práctica 1

Transporte de Glucosa en levaduras

Alumnos:

Briones Sandoval Carlos Raúl
Cruz Garduño Daniel
Guerrero López Diego
Mata Palafox Ana Laura
Ruiz Cuevas Francisco Israel

Grupo: 6QM1 Sección: IEquipo: 2

Fecha de entrega
12-Febrero-2013

Hipótesis
Si el transporte de glucosa en la levadura Saccharomyces cerevisiae, es pasivo mediado, se necesita una proteína de transporte, la cual se verá inhibida con cambios de temperatura, un agente bloqueador que cambie su conformación (N-etilmaleimida) y no por agentes desacoplantes de la fosforilación oxidativa (2,4-dinitrofenol).

DiseñoExperimental

Las células utilizadas son de procedencia comercial. Previo a la práctica la suspensión se lavó con la finalidad de eliminar cualquier rastro de medio de cultivo que pudiera existir en las células, pues este podría tener en su formulación glucosa, la cual, afectaría los resultados de nuestra práctica. Finalmente se obtuvo una suspensión celular con una concentración final de 30% v/v con elpropósito de tener la misma concentración de células para todos los equipos.
Se prepararon 5 matraces, dos de los cuales contenían 6 mL de agua destilada, 4 mL de suspensión celular y 10 mL de glucosa, la diferencia es que la solución del matraz 1 se mantuvo durante los 30 minutos del experimento a 4°C (con los reactivos adicionados previamente incubados a la misma temperatura) y el matraz 2, 3, 4 y5 se mantuvieron a temperatura ambiente.
El matraz 5 que se preparó sirvió como blanco de reactivos pues sólo contenía agua destilada y suspensión celular. El matraz 3 y 4 además de 10 mL de glucosa y 4 mL de suspensión celular contenían inhibidores que nos ayudarían a determinar qué tipo de transporte utiliza S. cerevisiae; en el matraz 3 se adicionó 6 mL de 2,4-dinitrofenol (DNF) el cual es undesacoplante de la fosforilación oxidativa al desacoplar la cadena de transporte de electrones, inhibiendo así la producción de ATP.
En el matraz 4 se adicionó 6mL de N-etilmaleimida (NEM) la cual se une a los grupos sufhidrilos, presentes en las proteínas de membrana de la levadura, provocando un cambio de conformación en éstas y evitando así que la glucosa se una a su proteína y pueda sertransportada al interior de la célula.
Se tomaron alícuotas de 2 mL de cada uno de los matraces a los tiempos 0, 10, 20 y 30 min. Fueron recibidos en tubos con 1 mL de hidróxido de sodio 0.5N, para así detener el transporte de glucosa al interior de la célula. Después se mezcló por agitación vigorosa y se obtuvo el sobrenadante con la finalidad de obtener exclusivamente la glucosa que no fue consumidapor S. cerevisiae, dejando de lado las levaduras con el azúcar consumido.
A partir de estos sobrenadantes se tomaron alícuotas de 0.2 mL y se llevaron a un volumen de 1 mL con agua destilada. Se adicionó el reactivo de DNS a cada tubo y se agitaron, después se colocaron a baño maría a ebullición por 10 min. El ácido 3, 5 dinitrosalicílico en presencia de calor se reduce a ácido 3-amino5-nitrosalicílico por los azúcares reductores presentes, desarrollándose un color amarillo el cual es estable por hasta 24 horas.
Se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se adicionaron 2 mL de agua destilada con la finalidad de tener un volumen adecuado para no provocar errores en la lectura del espectrofotómetro. La absorbancia se leyó a 540 nm, pues es a está longitud de onda a la cual esperamos seaposible leer el color obtenido en la reacción.

Objetivos
General
* Estudiar y comprobar cuál es el tipo de transporte de glucosa que utiliza Saccharomyces cerevisiae, mediante el uso de inhibidores bioquímicos.
Particulares:
* Observar el efecto de la temperatura en el sistema de transporte de glucosa que utiliza Saccharomyces cerevisiae.
* Observar el...