TRIPTICOS

WESTERN BLOT
Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.
Preparación de la muestra
En la mayoríade ensayos, las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida, de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico.
En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas parainmunotransferencia.


En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes, más utilizados habitualmente, según el tipo de proteína y localización subcelular.

Electroforesis en gel de Acrilamida
Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En primer lugar, las proteínas, se revisten con carga negativa, mediante la acción del detergenteDo-decilsulfato Sódico (SDS), así las proteínas, se pueden separar en el gel según su tamaño (SDS-PAGE).
Descripción del método
Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Los más habituales son los métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico (BCA).
Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos dedetección.
Elección del grosor del gel y del tamaño de poro

El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel.
 Los espaciadores de gel controlan el espesor del gel. Están disponibles en diversos tamaños.
 Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor volumen de carga. También se procesarán más lentamente y requieren tiemposde transferencia más largos que los geles más delgados.
 El porcentaje del gel, según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida, determina el tamaño del poro. A más porcentaje menos tamaño de poro.
 El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas.

Transferencia electroforética a una membrana
Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las proteínas se transfierena una membrana. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas, permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Lossistemas semisecos son más rápidos y requieren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos, sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa. Ambos métodos requieren, para una transferencia efectiva de las proteínas, un estrecho contacto entre el gel y la membrana.

Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incu-bando con unasolución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A me-nudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). La primera elección, cuando se inicia un nuevo protocolo, es la utilización de la leche des-cremada en polvo, ya que es más rentable que el BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina en lasfosfoproteínas, puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfo-específicos o en métodos de detección de biotina.
Hibridación del anticuerpo
Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario. En general, los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda ex-puesta al eliminar la estructura tridimensional de...