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PRÁCTICA 4
PRODUCCIÓN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS

OBJETIVOS
Generales

1. Cuantificar la producción de piruvato mediante la fermentación de la glucosa por levaduras
2. Determinar el efecto del pH de cultivo de las levaduras sobre la acumulación de piruvato

Particulares

1. Preparar un sistema fermentativo de la glucosa para la producción depiruvato
2. Elaborar una curva patrón de piruvato de sodio por espectrofotometría a una absorbancia de 505nm
3. Determinar cualitativamente la producción de piruvato mediante la reacción con nitroprusiato de sodio
4. Determinar cuantitativamente la producción de piruvato mediante 2, 4-dinitrofenilhidrazina.


INTRODUCCIÓN


En ausencia de oxígeno la única posibilidad desintetizar ATP en la mayoría de los organismos es la degradación de la glucosa hasta el piruvato. El NADH + H obtenido durante el proceso debe ser re-oxidado en forma continua a NAD para mantener la glucolisis y la síntesis de ATP. En los animales esto ocurre por la reducción del piruvato hasta lactato. En los microorganismos hay muchas otras formas de regeneración del NAD que se conocen comofermentaciones. Las características compartidas por todas las fermentaciones son que parten del piruvato y que solo tienen lugar en condiciones de anaerobiosis. (2)
En la fermentación alcohólica, el piruvato se convierte en etanol en dos pasos. El primer paso libera dióxido de carbono del piruvato, que se convierte en el compuesto de dos carbonos, acetaldehído. El segundo paso, el acetaldehído esreducido por el NADH a etanol. (2)
En la primera etapa, el piruvato procedente de la degradación de la glucosa, pierde su grupo carboxilo por acción de la piruvato descarboxilasa. Esta reacción es una sencilla descarboxilación en la que no se produce una oxidación neta del piruvato. La descarboxilasa precisa de Mg+2 y se halla unida íntimamente con la coenzima pirofosfato de tiamina, cuya funciónes la de transportador transitoria del grupo acetaldehído.
En la segunda etapa, el acetaldehído se reduce a etanol por el NADH en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa. (3) El centro activo del alcohol deshidrogenasa contiene un ion zinc coordinado a los átomos de azufre de dos residuos de cisteína y a un átomo de nitrógeno de una histidina. El ion zinc polariza el grupo carbonilo delsustrato para favorecer la transferencia de un hidruro desde el NADH (4). El NADH procede de la deshidrogenación del gliceraldehído 3-fosfato y aporta el poder reductor a la reacción que cataliza la deshidrogenasa del etanol. Los productos finales son, por tanto, etanol y CO2. (3)

Esto regenera la provisión de NAD necesaria para la continuación de la glucolisis. Muchas bacterias llevaban a cabola fermentación alcohólica en condiciones anaeróbicas. La levadura también lleva a cabo la fermentación alcohólica. Durante miles de años los seres humanos han empleado las levaduras en la fabricación de cerveza, de vinos y en la panificación. Las burbujas de CO2 generadas por la levadura del pan permiten que este leude. (1)

Reacción:


Se han encontrado reactivos que inhiben la formación delos productos de la vía, por tanto causan la acumulación de los metabolitos que luego, pueden identificarse como intermediarios de la vía.(5)
1. CAMPELL-REECE. 2005
2. KOOLMAN-RÖHM. 2004
3. MELO V- CUAMATZI O. 2006
4. BERG J. M- TYMOCZKO L. J. 2008
5. VOET DONALD- VOET- PRATT, 2007


MATERIAL
REACTIVOS

Micropipetas
Tubos de Ensaye 20mL
Cronómetros
Pipetas de 1, 5 y 10mLCentrífuga
Baño de agitación
Termómetro
Balanza
Gradillas
Baño María

Fosfato de Sodio dibásico 0.5M (20ml) ligeramente alcalino pH:8-9
Fosfato de potasio monobásico 0.5M (20ml) ligeramente ácido pH:4-5
Suspensión de levadura (100g/L) en Na2HPO4 0.5M
Suspensión de levadura (100g/L) en KH2PO4 0.5M
Glucosa al 10%
Nitroprusiato de sodio 5%
Hidróxido de amonio (amoniaco) concentrado
Sulfato de...