Técnica De Miller Modificada (Extracción De Dna)
Páginas: 2 (366 palabras)
Publicado: 24 de octubre de 2012
EXTRACCIÓN DE DNA POR LA TÉCNICA DE MILLER MODIFICADA
1. Colocar 3 ml de sangre periférica en un tubo con EDTA (tubo con tapa morada) y transferirlos a un tubo cónico de 15 ml.
2.Añadir de 3 ml de TTS y agitar en vórtex 15 minutos para provocar la lisis de los eritrocitos
3. Centrifugar a 300 rpm durante 8-10 minutos, para formar el botón de leucocitos.
4.Decantar el sobrenadante y añadir 1 ml de TTS al botón de células, sacudir el tubo contra una superficie dura hasta separar el botón del fondo.
5. Transferir el contenido a un tuboeppendorf de 1.5 ml y homogenizar en vórtex hasta disolver el botón.
6. Centrifugar a 12000 rpm 2 minutos, añadir 1 ml de TTS al botón de células y homogenizar en vórtex hasta disolverel botón blanco (repetir este paso de 2 a 3 veces hasta obtener un botón blanco)
7. Decantar el ultimo sobrenadante y añadir 570 µl de NaCl 5 mM, homogenizar 2 min en vórtex
8.Añadir 30 µl de SDS al 10 % y homogenizar 10 minutos en vórtex
9. Añadir 200 µl de NaCl saturado y homogenizar 15 minutos en vórtex.
10. Centrifugar a 11500 rpm por 25 min a 4°c11. Decantar el sobrenadante a un tubo de vidrio de 13 x 100 que contenga 2 ml de etanol absoluto frio
12. Incubar a -20 °C toda la noche
13. Colocar 500 µl de etanol al 70 %frio en u tubo eppendorf de 1.5 ml
14. Aspirar el DNA (fibra clara blanquecina) del tubo de 13 x 100 con una pipeta y punta de 100 µl y pasarlo al tubo de paso 13
15. Agitar envórtex 2 min y centrifugar a 9000 rpm por 10 min a 4 °C
16. Decantar el sobrenadante y añadir 500 µl de etanol al 70%. Repetir los pasos 15 y 16 de 2 a 3 veces.
17. Después de decantaren el ultimo lavado, estilar los tubos de 5-10 min para que se evapore todo el etanol.
18. Agregar de 300 a 400 µl de agua destilada estéril o hasta que la viscosidad sea la adecuada.
1. Colocar 3 ml de sangre periférica en un tubo con EDTA (tubo con tapa morada) y transferirlos a un tubo cónico de 15 ml.
2.Añadir de 3 ml de TTS y agitar en vórtex 15 minutos para provocar la lisis de los eritrocitos
3. Centrifugar a 300 rpm durante 8-10 minutos, para formar el botón de leucocitos.
4.Decantar el sobrenadante y añadir 1 ml de TTS al botón de células, sacudir el tubo contra una superficie dura hasta separar el botón del fondo.
5. Transferir el contenido a un tuboeppendorf de 1.5 ml y homogenizar en vórtex hasta disolver el botón.
6. Centrifugar a 12000 rpm 2 minutos, añadir 1 ml de TTS al botón de células y homogenizar en vórtex hasta disolverel botón blanco (repetir este paso de 2 a 3 veces hasta obtener un botón blanco)
7. Decantar el ultimo sobrenadante y añadir 570 µl de NaCl 5 mM, homogenizar 2 min en vórtex
8.Añadir 30 µl de SDS al 10 % y homogenizar 10 minutos en vórtex
9. Añadir 200 µl de NaCl saturado y homogenizar 15 minutos en vórtex.
10. Centrifugar a 11500 rpm por 25 min a 4°c11. Decantar el sobrenadante a un tubo de vidrio de 13 x 100 que contenga 2 ml de etanol absoluto frio
12. Incubar a -20 °C toda la noche
13. Colocar 500 µl de etanol al 70 %frio en u tubo eppendorf de 1.5 ml
14. Aspirar el DNA (fibra clara blanquecina) del tubo de 13 x 100 con una pipeta y punta de 100 µl y pasarlo al tubo de paso 13
15. Agitar envórtex 2 min y centrifugar a 9000 rpm por 10 min a 4 °C
16. Decantar el sobrenadante y añadir 500 µl de etanol al 70%. Repetir los pasos 15 y 16 de 2 a 3 veces.
17. Después de decantaren el ultimo lavado, estilar los tubos de 5-10 min para que se evapore todo el etanol.
18. Agregar de 300 a 400 µl de agua destilada estéril o hasta que la viscosidad sea la adecuada.
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.