técnicas de análisis histológico

 ANÁLISIS HISTOLÓGICO.
El análisis histológico se lleva a cabo mediante la realización de las técnicas de perfusión, extracción de cerebelo, corte de tejido, tinción histológica con la técnica de Nissl e inmunohistoquímica calbindina como marcadores de las células de Purkinje para su posterior conteo y comparación entre los tres grupos de estudio.

Perfusión
Para el análisis histológico enel día 21 de vida de las crías, se realizará una perfusión, que consiste en anestesiar a la rata con una sobredosis de pentobarbital con 0.15 ml a una concentración 6.3 g/100ml. Una vez anestesiado el individuo se procede a localizar el esternón y realizar un corte transversal y se pinza. Se corta lateralmente el diafragma por ambos lados hacia la cabeza por las costillas y paralelo a lospulmones, y se hace una punción intracardial a través del ventrículo izquierdo para realizar la perfusión. En este punto se introduce la aguja hasta que se vea a través de la aorta ascendente y se hace una incisión en la aurícula derecha para drenar la sangre.
Se pasarán 100–150 ml de solución salina 0.9% (heparinizada), y posteriormente 100–150 ml de paraformaldehído 4% en BF 0.1M con ácido pícrico 1%(1g de ac. Pícrico/100 ml de H2O; fotosensible) verificando que el pH sea de 7.4.

Extracción de cerebelo
Al término de la perfusión se decapita a la rata y se extrae el cerebelo. El tejido se coloca en un recipiente con solución de paraformaldehído 4% por 12h aproximadamente y después el tejido se cambia a un recipiente con solución de sacarosa con diferentes concentraciones 10% 24 hrs, 20%24 hrs y 30% 24 hrs. Una vez que el tejido se va al fondo del recipiente, indica que está listo para ser cortado.

Corte de tejido
Se realizarán cortes sagitales de 40 µm de grosor a nivel del vermis cerebelar a una temperatura de -25 ºC, mediante la utilización de un Crióstato (LEICA CM 1850). Posteriormente el tejido se guarda en una concentración de PB 0.1M o crioprotector a -4 ºC para suposterior montaje en porta objetos gelatinisados. Una vez que se monta el tejido, se deja secar por 24hrs.





Tinción histológica
Para la tinción del tejido se utiliza la técnica de tinción de Nissl (violeta de cresilo). El tejido ya montado en portaobjetos gelatinizados, se sumerge en agua destilada durante 1 minuto, 5 minutos en solución de violeta de cresilo al 5%, posteriormente endiferentes concentraciones de alcohol al 70%, durante 10 segundos y después por 1min en concentraciones de 90% y 100% respectivamente, posterior a esto, se sumergen los cortes en xileno durante 15 segundos y finalmente se coloca permount y cubreobjetos para su posterior análisis.

Inmunohistoquímica Calbindina

La calbindina es una proteína que tienen una amplia distribución y exhibe unmodelo de expresión de tipo específico en las células, estas pueden ser bien localizadas inmunocitoquímicamente en células selectas de muchas estructuras del SNC, se piensa que actúan como amortiguadores intracelulares o en el transporte de Ca +2 . La calbindina es un atractivo marcador nuronal. Los anticuerpos monoclonales reaccionan específicamente con calbindina D-28K que es utilizada comoinstrumento en la localización de calbindina en diferentes tejidos y poblaciones de células.

1.- Se realizan 3 lavados con buffer de fosfato (PB) 0.1M y de 6 a 8 si están en crioprotector, durante 5m c/u y 1 lavado con buffer de fosfato con Tritón (PBT) al 0.1% por 15m, todos en libre flotación y agitación constante; de esta forma se abre la membrana para la primera incubación.
2.- Para la eliminaciónde peroxidasas endógenas, se prepara una solución de peróxido de hidrógeno (H202) = 10 ml de PB 0.1M +180 µL H202 al 30%, durante 10m.
3.- Realizar 4 lavados con PB 0.1M durante 5m c/u y uno con PBT 0.1% por 10m en agitación constante.
4.- Preparar la solución de pre-bloqueo con suero de caballo al 5% en PB 0.1, aplicar al tejido en agitación constante y dejar por 1hr. De esta forma se...