Técnicas de Biología Molecular
Páginas: 5 (1098 palabras)
Publicado: 25 de septiembre de 2013
WESTERN BLOT/ INMUNOBLOT:
Es una técnica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada, esto se hace mediante una electroforesis en gel, se separan las proteínas, atendiendo al cireterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc; luego son transferidas a una membrana absorbente para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicoscontra ella. Finalmente se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto, y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.
SECUENCIACION:
La secuenciación de ADN es un conjunto de método y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T)en un oligonucleótido de ADN.
Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:
El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vectorapropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".
Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótidocorto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria alvector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatronucleótidos trifosfato en cada reacción.
Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, unavez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.
MICROARREGLOS:
La tecnología de microarreglos es una herramienta poderosa en el campo de la investigación biomédica, debido a que permite analizar diferentes tipos de muestras biológicas (tejidos, proteínas y material genético) y miles de moléculas de manera simultánea por ensayo, a diferencia de lo que ocurrecon otras técnicas de biología molecular (RT-PCR, PCR, Western blot, Northern blot, Southern
blot) en las cuales sólo se pueden analizar un número limitado de moléculas por ensayo.
La versatilidad de esta técnica permite utilizarla en estudios de dosis-respuesta, para establecer perfiles de expresión diferencial de genes en condiciones experimentales distintas (enfermedades, tratamientos,etc.), en el análisis de polimorfismos, presencia de metilaciones, mutaciones puntuales, identificación de blancos terapéuticos, etc.
En términos generales, un microarreglo se encuentra integrado por dos partes, el material biológico o sintético denominado como prueba y el soporte sólido en el cual se inmovilizan o adsorbe el material biológico; este material puede ser de distintas naturalezas;...
Es una técnica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada, esto se hace mediante una electroforesis en gel, se separan las proteínas, atendiendo al cireterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc; luego son transferidas a una membrana absorbente para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicoscontra ella. Finalmente se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto, y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.
SECUENCIACION:
La secuenciación de ADN es un conjunto de método y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T)en un oligonucleótido de ADN.
Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:
El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vectorapropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".
Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótidocorto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria alvector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatronucleótidos trifosfato en cada reacción.
Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, unavez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.
MICROARREGLOS:
La tecnología de microarreglos es una herramienta poderosa en el campo de la investigación biomédica, debido a que permite analizar diferentes tipos de muestras biológicas (tejidos, proteínas y material genético) y miles de moléculas de manera simultánea por ensayo, a diferencia de lo que ocurrecon otras técnicas de biología molecular (RT-PCR, PCR, Western blot, Northern blot, Southern
blot) en las cuales sólo se pueden analizar un número limitado de moléculas por ensayo.
La versatilidad de esta técnica permite utilizarla en estudios de dosis-respuesta, para establecer perfiles de expresión diferencial de genes en condiciones experimentales distintas (enfermedades, tratamientos,etc.), en el análisis de polimorfismos, presencia de metilaciones, mutaciones puntuales, identificación de blancos terapéuticos, etc.
En términos generales, un microarreglo se encuentra integrado por dos partes, el material biológico o sintético denominado como prueba y el soporte sólido en el cual se inmovilizan o adsorbe el material biológico; este material puede ser de distintas naturalezas;...
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