Técnicas de inmunodifusión

INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA Trabajo Práctico Nº2: Inmunodifusión
Eva Acosta Rodriguez
eacosta@mail.fcq.unc.edu.ar

Objetivo general: - Adquirir herramientas para evaluar, identificar y cuantificar Ags o Acs mediante técnicas de inmunoprecipitación Objetivos específicos: - Determinar cuantitativamente la IgG purificada en el TP Nº 1 mediante IDRS (Mancini) - Determinar medianteelectroinmunodifusión la posible presencia de proteínas séricas contaminantes en la IgG purificada

Interacciones Ag-Ac
Interacción bimolecular reversible
Puente H

Determinante antigénico (epitope)

Enlace iónico I. hidrofóbicas I. van der Waals

Dominio variable del Ac

interacciones débiles interacción Ag-Ag fuerte requiere gran número de estas interacciones alta complementariedadESPECIFICIDAD

Gran especifidad de la interacción Ag-Ac

Desarrollo de ensayos inmunológicos para detectar o cuantificar Ags o Acs

UTILIDADES DE LOS INMUNOENSAYOS
• Diagnóstico de enfermedades • Monitoreo de la respuesta inmune humoral • Identificación de moléculas biológicas o de interés médico

Tipos de interacciones Ag-Ac
Primaria:
- primera etapa - unión directa del Ac al Ag - novisualizable, sin fenómenos asociados - relativamente independiente de Tº y fuerza iónica

ENZIMOINMUNOENSAYO INMUNOFLUORESCENCIA RADIOINMUNOANALISIS

Secundaria:
- segunda etapa: agregación de los complejos formados en la interacción 1ria - fenómenos visibles a simple vista: precipitación o aglutinación - dependientes de Tº, pH, fuerza iónica, etc

AGLUTINACION INMUNODIFUSIONELECTROINMUNODIFUSION

Terciaria:
- solo en interacciones “in vivo” - efectos biológicos colaterales a la interacción (necrosis en la reacción de Arthus, efectos vasógenos y de miocontracción en anafilaxia)

Reacciones de inmunoprecipitación
Interacción entre un Ac y un Ag soluble en solución acuosa

Formación de complejos multimoleculares

Desarrollo de precipitados visibles

Factoresfísicoquímicos

Características inmunoreactantes

Proporción relativa de Ag y Ac

• Factores físico-químicos
• temperatura • fuerza iónica • pH • viscosidad

afectan la difusión de los inmunoreactantes

Difusión: movimiento de una sustancia disuelta desde el lugar de mayor concentración al de menor concentración tendiente a igualar las concentraciones en el seno del líquido
Q: cantidad desustancia que difunde t: tiempo D: coeficiente de difusión A: área de difusión C: concentración inicial x: distancia recorrida Tº: temperatura V: volumen de la sustancia que difunde

Ley de Fick
(difusión libre unidimensional en medio fluido)

dQ = − D.A. dC dt dx D = cte.T º V

• Características de los inmunoreactantes
Ac
• bivalente • no fragmentos F(ab)

complejos pequeños solublescomplejos grandes insolubles

Ag

• bivalente (al menos dos copias del mismo epitope) •distintos epitopes (reaccionan con distintos Acs del As)
complejos grandes insolubles

complejos pequeños solubles

• Proporción relativa de Ag y Ac
La composición del enrejado (y su solubilidad) varían de acuerdo a la concentración relativa de los inmunoreactantes

+1

+3

+5

+7

+9

sinprecipitado

precipitado

ppdo máximo

precipitado

sin precipitado

Composición de los complejos
Zona de exceso de Ac Zona de equivalencia Zona de exceso de Ag

Sobrenadante

exceso Ac exceso Ag

++++ + - -- -- - - -

- + +

- + +

Precipitado

Prozona
Ag agregado

Métodos de inmunodifusión
Sirven para determinar la concentración de Ags o Acs (cuantitativos), opara comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos) Utilizan medios gelificados (agar o gelatina) para evitar disturbios ocasionados por las corrientes en el fluido •Tamaño de poros que permiten la libre difusión de inmunoreactantes •Ausencia de reacción física ó química entre los inmunoreactantes y el gel

Ley de Fick

El tamaño de los poros debe retener los inmunocomplejos facilitando la...