Técnicas diagnosticas en biomedicina molecular
Páginas: 51 (12735 palabras)
Publicado: 11 de agosto de 2013
1. Manipulación de los ácidos nucleicos
1.1 Extracción y purificación…………………………………………….2
1.2 Electroforesis en gel de agarosa…………………………………..8
1.3 PCR y RT-PCR………………………………………………………12
1.4 Secuenciación………………………………………………………..
1.5 Enzimas de restricción y ligación.………………………………....
1.6 Vectores de clonación…………………………………………........
1.7 Clonación molecular de un gen…………………………………….
1.8Análisis bioinformático……………………………………………….
2. Análisis de proteínas……………………………………………………………..
2.1 Vector de expresión.………………………………………………….
2.2 Expresión de una proteína recombinante………………………….
2.3 Cuantificación colorimétrica de proteínas..…………………………
2.4 Análisis electroforético en gel de acrilamida………………………..
2.5 Purificación de proteínas……………………………………………..
2.6 Ensayo de Western blot yELISA…………………………………....
Extracción y purificación de ácidos nucleicos
Los métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos es la primera etapa en la mayoría delos estudios de biología molecular y todas las técnicas de recombinación del ADN.
Los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados de diversas fuentes para después realizar análisis específicosde modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Las utilidades posteriores para el motivo de extracción y purificación de ácidos nucleicos incluye estudios de casos de filiación, mezcla de fluidos, agresiones sexuales, diagnóstico de enfermedades, evaluar los niveles de expresión génica, modificación genética, entre otros.
La elección del método se efectúa segúnlos siguientes criterios:
• Ácido nucleico diana
• Organismo fuente
• Material inicial
• Resultados deseados
• Uso posterior
Las células más utilizadas como fuente de ADN son los leucocitos de sangre periférica pero también se utilizan otros tejidos como el hígado, bazo, riñón,
o incluso tejido óseo.
Desde un punto de vista práctico ADN puede extraerse a partir de:
TEJIDO FRESCO(Tejidos sólidos, sangre total, células blancas).
MUESTRAS CONGELADAS: Idealmente, el ADN de mejor calidad (menos degradado por nucleasas) se extraerá de muestras frescas, pero, en el caso de números importantes de muestras a procesar, éstas pueden ser conservadas para realizar la extracción posteriormente
MUESTRAS EN PARAFINA: El procedimiento de extracción es más laborioso y largo. Elrendimiento es más bajo y el ADN está fragmentado.
En la siguiente tabla se muestran volúmenes y parámetros sobre la recogida de las muestras para el estudio de ácidos nucleicos.
El ADN es muy estable y solo se necesita mantener las muestras congeladas antes de su extracción. Se necesita separarlo de cualquier otro compuesto celular o ambiental. Se debe primero llevara cabo una lisis paraliberar el ADN del interior celular. Lo anterior utilizando buffers de extracción que contienen:
Un agente quelante, EDTA(ácido etileno amino tetra acético, 50mM ) Con 4 grupos carboxilo y 2 grupos amino. Su forma deprotonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución, quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir las ADN asas.
Sales queforman una capa iónica que recubre el ADN protegiéndolo y evitando su degradación
Tris HCl 20 Mm con pH entre7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solución estable
Proteinasa K (0.5 ml ml-1) para degradar proteínas
-Tratamiento de las muestras con 2 extracciones de fenol para eliminar las proteínas. Se agrega de fenol el mismo volumen de la muestra, se mezcla, se centrifuga a 10, 000 RPM x gdurante 3 minutos y se recupera el sobrenadante.
Después de la extracción con fenol se suele llevar a cabo otra extracción con cloroformo para acabar de limpiar la muestra de residuos lipídicos.
Una vez más, se agrega igual volumen de cloroformo que la muestra, se mezcal bien y se centrifuga para recuperar el sobrenadante.
La precipitación de ADN con etanol absoluto y una sal de...
1. Manipulación de los ácidos nucleicos
1.1 Extracción y purificación…………………………………………….2
1.2 Electroforesis en gel de agarosa…………………………………..8
1.3 PCR y RT-PCR………………………………………………………12
1.4 Secuenciación………………………………………………………..
1.5 Enzimas de restricción y ligación.………………………………....
1.6 Vectores de clonación…………………………………………........
1.7 Clonación molecular de un gen…………………………………….
1.8Análisis bioinformático……………………………………………….
2. Análisis de proteínas……………………………………………………………..
2.1 Vector de expresión.………………………………………………….
2.2 Expresión de una proteína recombinante………………………….
2.3 Cuantificación colorimétrica de proteínas..…………………………
2.4 Análisis electroforético en gel de acrilamida………………………..
2.5 Purificación de proteínas……………………………………………..
2.6 Ensayo de Western blot yELISA…………………………………....
Extracción y purificación de ácidos nucleicos
Los métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos es la primera etapa en la mayoría delos estudios de biología molecular y todas las técnicas de recombinación del ADN.
Los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados de diversas fuentes para después realizar análisis específicosde modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Las utilidades posteriores para el motivo de extracción y purificación de ácidos nucleicos incluye estudios de casos de filiación, mezcla de fluidos, agresiones sexuales, diagnóstico de enfermedades, evaluar los niveles de expresión génica, modificación genética, entre otros.
La elección del método se efectúa segúnlos siguientes criterios:
• Ácido nucleico diana
• Organismo fuente
• Material inicial
• Resultados deseados
• Uso posterior
Las células más utilizadas como fuente de ADN son los leucocitos de sangre periférica pero también se utilizan otros tejidos como el hígado, bazo, riñón,
o incluso tejido óseo.
Desde un punto de vista práctico ADN puede extraerse a partir de:
TEJIDO FRESCO(Tejidos sólidos, sangre total, células blancas).
MUESTRAS CONGELADAS: Idealmente, el ADN de mejor calidad (menos degradado por nucleasas) se extraerá de muestras frescas, pero, en el caso de números importantes de muestras a procesar, éstas pueden ser conservadas para realizar la extracción posteriormente
MUESTRAS EN PARAFINA: El procedimiento de extracción es más laborioso y largo. Elrendimiento es más bajo y el ADN está fragmentado.
En la siguiente tabla se muestran volúmenes y parámetros sobre la recogida de las muestras para el estudio de ácidos nucleicos.
El ADN es muy estable y solo se necesita mantener las muestras congeladas antes de su extracción. Se necesita separarlo de cualquier otro compuesto celular o ambiental. Se debe primero llevara cabo una lisis paraliberar el ADN del interior celular. Lo anterior utilizando buffers de extracción que contienen:
Un agente quelante, EDTA(ácido etileno amino tetra acético, 50mM ) Con 4 grupos carboxilo y 2 grupos amino. Su forma deprotonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución, quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir las ADN asas.
Sales queforman una capa iónica que recubre el ADN protegiéndolo y evitando su degradación
Tris HCl 20 Mm con pH entre7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solución estable
Proteinasa K (0.5 ml ml-1) para degradar proteínas
-Tratamiento de las muestras con 2 extracciones de fenol para eliminar las proteínas. Se agrega de fenol el mismo volumen de la muestra, se mezcla, se centrifuga a 10, 000 RPM x gdurante 3 minutos y se recupera el sobrenadante.
Después de la extracción con fenol se suele llevar a cabo otra extracción con cloroformo para acabar de limpiar la muestra de residuos lipídicos.
Una vez más, se agrega igual volumen de cloroformo que la muestra, se mezcal bien y se centrifuga para recuperar el sobrenadante.
La precipitación de ADN con etanol absoluto y una sal de...
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