técnicas en bioquímica

Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”
Sede Aragua
Departamento de Bioquímica y Fisiología












Preparador Carlos Y. Pérez V.
Preparadora Mariela del C. Perozo M.


Abril 2013
Técnicas en Bioquímica

1. Fraccionamiento Subcelular

Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtenerfracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular: organelas, complejos multiprotéicos, fracciones de membrana; las cuales deben encontrarse en condiciones que permitan su aislamiento.
Etapas:
Ruptura de las células o tejidos Fracción deseada

Separación de la fracción deseada del resto de los componentes celulares

1) Identificar el objetivo (célula, organela,molécula)

2) Fuente Facilidad de obtención
Abundancia del tejido en la muestra

3) Definir método Condiciones (temperatura y pH)

2. Homogenización

Rompimiento de las células o el tejido del cual se pretende extraer la organela o molécula de interés. Ruptura de las estructuras que sostienen y unen las células, además de los mismos elementos subcelulares,liberándolos en suspensión con el mínimo daño funcional y estructural. Procedimientos de homogenización más comunes:
Sonicación: ruptura celular mediante ultrasonido
Detergentes: tensoactivos
Filtro a presión
Homogenizadores: por mortero o con embolo. Fuerza de fricción
Licuadoras (disruptor de cuchillas de alta velocidad)
3. Centrifugación

Método por el cual se pueden separar sólidos delíquidos de diferente densidad. La centrifugación imprime un movimiento rotatorio con una fuerza mayor a la fuerza de gravedad, provocando la sedimentación de las partículas más densas.

Fuerza centrífuga: fuerza que genera el eje

Fuerza de resistencia del medio líquido a ser desplazado por la partícula: densidad del líquido

Fuerza de fricción de la partícula con el medio liquido al moverse:depende de la velocidad y forma del cuerpo y de las propiedades del líquido

Fuerza neta: Fc – Fr – Ff

Coeficiente de Sedimentación: Velocidad a la que se desplaza una partícula en el campo centrífugo.

- Rotor basculante: se mueve la muestra
- Rotor fijo: posee cavidades para las muestras








Centrifugación diferencial: Separación por peso mediante ciclos cortos develocidad









Centrifugación por gradiente de densidad:

Separación de partículas según la densidad, mediante el empleo de un gradiente de diversas densidades (sacarosa). Al centrifugar cada componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no sedesplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas  al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación.
La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llamacentrifugación isopícnica. En este punto no se producirá una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Puesto que la mayoría de las proteínas poseen casi la misma densidad, este método no se suele utilizar para su separación. Sinembargo, en situaciones donde intervienen diferentes densidades, la centrifugación isopícnica es el método adecuado. Esto es cierto para moléculas, tales como ácidos nucléicos, así como diferentes organelos celulares. 








4. Cromatografía

Proceso que se caracteriza por el paso uniforme de una mezcla diluida (fase móvil) a través de otra sustancia relativamente...