Ultracentrifugación

ULTRACENTRIFUGACIÓN

La ultracentrífugación fue ideada en 1923 por el bioquímico sueco Svedberg, puede alcanzar velocidades tan elevadas como 80.000 rpm, de modo que genera campos centrífugos que superan 600.000 g. La ultracentrifugación se ha convertido en una herramienta indispensable para el aislamiento de proteínas, ácidos nucleicos y partículas subcelulares.
Sedimentación
Lavelocidad a la que una partícula sedimenta en la ultracentrífugación está relacionada con su masa. La fuerza, F (sedimentación), que actúa para sedimentar una partícula de masa m, que está situada a una distancia r del centro alrededor del cual se halla girando con velocidad angular ω (en rad • s), es la fuerza centrífuga (mω2w r) sobre la partícula menos la fuerza de flotación (Vω r) ejercida por ladisolución:
F = mω2r - Vω r
V es el volumen de la partícula y la densidad de la disolución.
La velocidad con que sedimenta una partícula, está en relación con su coeficiente de sedimentación (s). Este coeficiente es reflejo del tamaño y forma de la partícula o molécula y de él depende la velocidad con que ésta sedimenta.
Ultracentrifugación preparativa
Consiste en aislar losmateriales biológicos para ulteriores investigaciones bioquímicas. Los rotores preparativos contienen tubos cilíndricos para las muestras, cuyos ejes pueden ser paralelos, formar un cierto ángulo o ser perpendiculares al eje de rotación del rotor.
La sedimentación puede llevarse a cabo en una disolución de una sustancia inerte, tal como sacarosa o CsCl, en la que la concentración y por tanto ladensidad de la disolución, aumentan desde la superficie hasta el fondo del tubo de centrífuga. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones, el sedimento y una disolución sobrenadante que puede separarse por decantación o aspiración. La utilización de este tipo de gradientes de densidad, aumenta en gran medida la capacidad de resolución de la ultracentrífuga. Según las determinaciones a realizaraplicaremos el tipo de gradiente de densidad más conveniente:
• Ultracentrifugación de zona
• Ultracentrifugación con gradiente de densidad en equilibrio
Ultracentrifugación con gradiente de densidad en equilibrio
Separa las partículas de acuerdo con sus densidades. Este tipo de centrifugación separa mezclas cuyos componentes posen un intervalo en sus densidades. No solo permite laseparación de varios o de todos los componentes de una mezcla en una sola vez, sino que también posibilita la realización de medidas de tipo analítico en cada uno de ellos.
El método consiste en una columna de fluido soporte cuya densidad se incrementa hacia el fondo del tubo. El fluido se confecciona con un soluto asequible de bajo peso molecular en un disolvente en el que las partículas de la mezclapuedan ser suspendidas. Existen dos técnicas basadas en este método: La centrifugación zonal y la isopícnica.
Ultracentrifugación zonal
Separa las partículas de acuerdo con sus coeficientes de sedimentación. La ultracentrifugación de zona separa las macromoléculas basándose ampliamente en sus masas moleculares.
Ultracentrifugación isopícnica
En esta técnica el gradiente de densidad de lacolumna viene determinado por el rango total de densidades de las partículas de la muestra. Cada partícula sedimentará en aquella posición del tubo de centrífuga en la que la densidad del gradiente sea igual a su propia densidad.
Centrifugación de una mezcla uniforme macromolecular disuelta en una disolución de un soluto denso que se difunde con rapidez, tal como CsCl. 4
Ultracentrifugaciónanalítica
Difiere de la preparativa en que se utiliza fundamentalmente para el estudio de las características de sedimentación de macromoléculas y estructuras biológicas, de este modo se sacan conclusiones acerca de parámetros físico-químicos de dichos compuestos.
Se emplean rotores especiales. La aplicación más habitual en los laboratorios de bioquímica es la determinación de pesos...