Un método mejorado para la preparación a gran escala de ADN plásmido superenrollado negativamente y positivamente

Biotechniques. 2009 July; 2009 de julio; 47(1): 633–635. 47 (1): 633-635.
An improved method for large-scale preparation of negatively and positively supercoiled plasmid DNA Un método mejorado para la preparación a gran escala de ADN plásmido superenrollado negativamente y positivamente
Marita C. Barth , Debra A. Dederich , and Peter C. Dedon Marita C. Barth , Debra A. Dederich y Peter C.Dedon
Abstract Abstracto
A rigorous understanding of the biological function of superhelical tension in cellular DNA requires the development of new tools and model systems for study. Una comprensión rigurosa de la función biológica de la tensión superhelical en el ADN celular requiere el desarrollo de nuevas herramientas y sistemas modelo para el estudio. To this end, an ethidium bromide-freemethod has been developed to prepare large quantities of either negatively or positively supercoiled plasmid DNA. Para este fin, un método de bromuro de etidio libre ha sido desarrollado para preparar grandes cantidades de ya sea positiva o negativamente el ADN plásmido superenrollado. The method is based upon the known effects of ionic strength on the direction of binding of DNA to an archaealhistone, rHMfB, with low and high salt concentrations leading to positive and negative DNA supercoiling, respectively. El método se basa en los efectos conocidos de la fuerza iónica sobre la dirección de la unión de ADN a una histona archaeal, rHMfB, con bajas y altas concentraciones de sal que conducen a superenrollamiento del ADN positivo y negativo, respectivamente. In addition to fully optimizedconditions for large-scale (> 500 μg) supercoiling reactions, the method has the advantage of avoiding the use of mutagenic ethidium bromide, of applicability to chemically modified plasmid DNA substrates and of producing both positively and negatively supercoiled DNA using a single set of reagents. Además de las condiciones totalmente optimizados para a gran escala (> 500 microgramos)superenrollamiento reacciones, el método tiene la ventaja de evitar el uso de bromuro de etidio mutagénico, de aplicabilidad a modificar químicamente sustratos de ADN de plásmido y de producir tanto positiva como negativamente supercoiled DNA utilizando un único conjunto de reactivos.
INTRODUCTION INTRODUCCIÓN
DNA supercoiling is ubiquitous in prokaryotic and eukaryotic genomes and has clear effects onmany cellular functions. Superenrollamiento del ADN es ubicuo en los genomas de procariotas y eucariotas y tiene efectos claros en muchas funciones celulares. The study of superhelical tension in DNA, however, has been hampered by the paucity of methods to prepare sizeable quantities of supercoiled plasmid DNA as a model system. El estudio de la tensión superhelical en el ADN, sin embargo, ha sidoobstaculizada por la escasez de métodos para preparar cantidades considerables de ADN plásmido superenrollado como un sistema modelo. Several methods exist to prepare either positively or negatively supercoiled plasmid DNA, but these methods are limited by low superhelical density, small preparation size, availability of crucial enzymes, or the need to use highly mutagenic ethidium bromide thatcauses significant nicking of the plasmid DNA. Existen varios métodos para preparar ya sea positiva o negativamente ADN plásmido superenrollado, pero estos métodos están limitados por la baja densidad superhelicoidal, pequeño tamaño de la preparación, la disponibilidad de enzimas cruciales, o la necesidad de utilizar bromuro de etidio altamente mutagénico que causa la formación de muescassignificativa del ADN plásmido. To date, no single method provides both positively and negatively supercoiled plasmid in parallel and biochemically-similar reactions for use in comparative studies of supercoiled DNA. Hasta la fecha, ningún método proporciona tanto positiva como negativamente plásmido superenrollado en reacciones paralelas y bioquímicamente similares para su uso en estudios comparativos de...