Uso De Filtros Nucleopore

Hobbie, J. E., Daley, R. J. and Jasper, S. (1977). Use of Nuclepore Filters for Counting
Bacteria by Fluorescence Microscopy. Appl. Environ. Microb., 33, (5):1225-1228.

La tecnología desarrollada por Hobbie et al (1977) para el recuento bacteriano es una metodología clásica que después ha sido modificada para utilizarse con otros fluorocromos o para la estimación bacteriana con diferentesobjetivos investigadores. Si tuviese que realizar un recuento de bacterias en un medio acuático natural con la metodologías descritas por Hobbie et al., debería tener en cuenta ciertas características de esta técnica. Conteste a las siguientes cuestiones.

a) Debe comprobar si el microscopio de fluorescencia que tienen en su laboratorio se puede utilizar para el recuento. ¿Qué tipo de bloque defiltros ópticos debería utilizar en el microscopio de epifluorescencia para poder detectarlas?
Dos microscopios han dado buenos resultados con esta técnica:
- Un microscopio Leitz Ortholux equipado con un iluminador Ploem, una lámpara HBO-200, un filtro de calor, un filtro excitador BG-38, uno o dos filtros excitadores KP490, un separador de haz TK510 y un filtro de barrera K510 (el sistema defiltros Ploemopak es aún mejor).
- Un microscopio Zeiss Standard 18 equipado con un condensador de epifluorescencia IV FL, una lámpara halógena de 100W, un filtro band-pass 455-500, un separador de haz 510 y un filtro de barrera LP 528.

b) En esta metodología se utilizan un tipo de filtros “nucleopore”. ¿Qué tipo de filtros son? ¿Qué ventaja tienen con respecto a otros filtros utilizadospreviamente para realizar recuento? ¿Qué tamaño de poro sería idóneo para realizar el recuento?
Los filtros nucleopore son filtros de policarbonato que pueden presentar un tamaño de poro muy pequeño de 0.2 µm hasta poros de 25 mm de diámetro, por tanto pueden ser retenidas en él partículas muy pequeñas.
Las ventajas que presenta frente a los filtros de celulosa que se utilizaban anteriormente, esque presentan un tamaño de poro uniforme y presentan una superficie plana que retiene todas las bacterias en la parte superior del filtro. Aunque los filtros de celulosa también retienen todas las bacterias, muchas se quedan atrapadas en el interior del filtro donde no se pueden contar. Antes de usar el filtro nucleopore éste se debe colorear con irgalan negro para eliminar la autofluorescencia.Los recuentos bacterianos en lagos y océanos cuando se hacen con nucleopore son el doble de los realizados con filtros de celulosa.
En la medida en que los poros de los filtros tienen tamaño más pequeño hay la posibilidad de realizar el recuento de más cantidad de bacterias, debido a que las bacterias encontradas en el agua fresca, sedimentos, suelo, lagos y agua de mar son bacterias muy pequeñas.De acuerdo con este estudio, al filtrar agua de un lago a través de filtros con poros de diámetro de 0.4 µm fueron retenidas el 56% de las bacterias y al utilizar filtros con poros de 0.2 µm (nucleopore) fueron retenidas el 99%. Al utilizar filtros con poros de 1 µm de diámetro pueden ser retenidas el 100% de las bacterias.

c) La observación del filtro nucleopore al microscopio con lasbacterias fluorescentes, muestra una distribución no homogénea de estas sobre el filtro, con zonas en las que no aparecen bacterias. ¿Esto a que se debe? ¿Cómo se podría corregir?
Esto se debe a que algunos lotes de filtros de nucleopore son parcialmente hidrofóbicos. Para corregirlo se colocan varias gotas de un surfactante al 0.5% por encima y por debajo del filtro y se aplica vacío brevemente parahumedecer el filtro. Esto se hace inmediatamente antes de filtrar la muestra y debe hacerse rápidamente para evitar la decoloración. En lo posible no se debe usar el surfactante ya que éste incrementará el background de la fluorescencia en algunos tipos de agua. Es vital que las bacterias sean examinadas mientras el filtro aún esté húmedo. El recuento debe hacerse máximo una hora después de la...