utilidad endonucleasas

UTILIDAD ENDONUCLEASAS
Aplicaciones de las enzimas de restricción:
-Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.
-Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.
-Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.
-Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNArecombinante.
·        Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que sehan aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI  E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
·        Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos:
GAATTC GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG AACGAA
EcoRIBamHI HindIII
2.      Abruptos:
AATATT CCCGGG
TTATAA GGGCCC
SspI SmaI
·        Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:
1.      Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muydependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2.      Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.
3.      DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .
4.      Contaminantes con carga (-).
5.      DNAcontaminado con otro DNA.
6.      Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
7.      Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
8.      Buffer adecuado – este provee elambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.
·      Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.
·      El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión
IMPORTANCIA DE ENDONUCLEASAS
En la actualidad esta técnica es utilizada principalmente como una alternativa paralos aislamientos de estafilococos que contienen frecuentemente plasmidos múltiples, y para seleccionar especies de Enterobacteriaceae que tienen a menudo grandes plasmidos característicos.
Algunas cepas de bacterias contienen solamente un plasmido grande, de un rango de tamaño de 100 a 150 Kilobases (kb). Debido a que es difícil de diferenciar plasmidos en este rango de tamaño, especialmente losque varían solamente de 10 a 15 kb, algunos investigadores han adicionado una endonucleasa de restricción para aumentar el poder de discriminación de la electroforesis en gel de agarosa. Esto puede ser útil cuando los plasmidos grandes producen muchos fragmentos de restricción que puede hacer la interpretación más difícil, especialmente cuando están presentes plasmidos múltiples grandes (Tenover etal., 1997).
Actualmente, la REAP ha mejorado en su reproducibilidad y poder de discriminación por lo que es la técnica preferida de tipificación de plasmidos y es de particular interés para la realización de estudios epidemiológicos de infecciones institucionales con organismos resistentes a múltiples antibióticos. Utilizado conjuntamente con delineación clonal por tipificación de ADN...