Valoración De La Inmunidad Celular

PRACTICA # 5
TEMA: TECNICAS PARA VALORACION DE INMUNIDAD CELULAR IN VITRO
OBJETIVOS
* Conocer el procedimiento empleado en las diferentes técnicas para valorar la inmunidad celular.
* Identificar los métodos más utilizados.

MARCO TEÓRICO
TECNICAS PARA VALORACION DE INMUNIDAD CELULAR IN VITRO
1. Técnicas Cuantitativas: Separación de linfocitos de Sangre periférica
*Ficoll-Hypaque
* Valoración de los receptores para eritrocitos de carnero
* Citometria de flujo
* Esferas magnéticas

2. Técnicas Cualitativas
* Estimulación blástica
* Cultivo mixto de linfocitos

TECNICAS CUANTITATIVAS: SEPARACIÓN DE LINFOCITOS DE LA SANGRE PERIFERICA

FICOLL-HYPAQUE
La separación de linfocitos de sangre periférica por centrifugación diferencial en ungradiente de densidad, con Ficoll-Hypaque, es una técnica rápida con una pureza superior al 90 % y una viabilidad de prácticamente el 100%. Las células así obtenidas se denominan PBMC (peripheral blood mononuclear cells). La técnica fue descrita inicialmente por Boyum, y también se utiliza para separar linfocitos de otros fluidos de tejidos disociados.

No son necesarias condiciones de esterilidad,pero es conveniente que los reactivos conserven para evitar la contaminación bacteriana o fúngica.
Con esta técnica pueden recuperarse los neutrófilos que se obtienen sobre la fracción de eritrocitos, para ello deben lisarse los eritrocitos con cloruro amónico. Los neutrófilos obtenidos deben ser lavados y re suspendidos en el medio deseado.

Los linfocitos son junto con los monocitos, lascélulas de menor densidad de las presentes en la sangre periférica, densidad inferior a 1,077 g/dl. Por ello, utilizando gradientes de densidad podemos separar y posteriormente aislar dichas células.

Procedimiento
* Se extrae sangre utilizando heparina como anticoagulante y se diluye con un volumen igual de cloruro de sodio al 0,9%.
* La sangre diluida se deposita en un tubo de centrífugasobre la solución de Ficoll-Hypaque.
* Se centrifuga a poca velocidad (400 X g) durante 30 min, a temperatura ambiente.

Los linfocitos, junto con monocitos y plaquetas, se agrupan en la interfase entre el Ficoll-Hypaque y el espécimen original, mientras que los eritrocitos y los granulocitos van al fondo del tubo. Las células mononuleares se recogen con una pipeta Pasteur y se lavan dos vecescon cloruro sódico al 0,9% y se centrifuga para separar las plaquetas.
En esta centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque se separan juntos linfocitos y monocitos.
Para separar los monocitos contaminantes, hay varios métodos, uno de los cuales aprovecha las propiedades fagocíticas de los monocitos. Para ello, se incuba a 37 °C entre 30 y 60 min la preparación de células mononucleares conpartículas de látex de 0,8 um de diámetro recubiertas de IgG, o con partículas de hierro recubiertas de polilisina. Producida la fagocitosis, los monocitos se separan por centrifugación, en el caso de las partículas de látex, o haciendo pasar las células por campos magnéticos en el de las partículas de hierro. Con la centrifugación los monocitos se depositan en el fondo del tubo y, con los camposmagnéticos, quedan retenidos y pegados a las paredes del mismo.

VALORACIÓN DE RECEPTORES PARA ERITROCITOS DE CARNERO
Al inicio de la década de 1970, investigadores de varios laboratorios informaron sobre el hallazgo de una fracción de los linfocitos sanguíneos humanos que poseía la propiedad de unirse a eritrocitos de carnero, formando agregados en forma espontánea que se denominaron rosetas.Posteriormente se determinó que dicha fracción corresponde exclusivamente a los linfocitos T. Desde entonces, el método de formación de rosetas entre linfocitos T humanos y eritrocitos de carnero (rosetas E) ha sido un procedimiento ampliamente difundido en inmunología clínica, y se ha utilizado principalmente para dos propósitos: la cuantificación de los linfocitos T en diversos tipos de...