Varios

Se basa en la exposición de mezclas proteicas a un campo eléctrico, en un soporte semisólido y poroso. Cada proteína emigra al polo de carga opuesta, con una movilidad que depende de la relación entre su carga y su musa. El medio más utilizado es el gel de poliacrilamida, controlable en cuanto a condiciones de poros y pH, que posee la consistencia adecuada para que una vez realizada laseparación, se puedan revelar las proteínas, identificarlas, cuantificarlas y transferirlas a un segundo soporte, generalmente papel (en la técnica de Western).

La electroforesis se puede utilizar como técnica de estudio de cualquier molécula cargada, y de hecho es también muy utilizada en el campo de los ácidos nucleicos. En este caso el gel soporte más utilizado suele ser agarosa, sobre todo paracadenas grandes, aunque la poliacrilamida es también de gran utilidad si los fragmentos son pequeños, como por ejemplo ocurre cuantío se trata de secuenciar ADN. Las cubetas de agarosa y el sentido de la electroforesis suele ser horizontal, mientras que los geles de poliacrilamida suelen montarse en vertical. Asimismo, como complemento a las técnicas más sofisticadas relacionadas con la cuantificaciónde los ácidos nucleicos, como la RT-PCR, se utilizan algunas versiones sofisticadas de electroforesis, como la electroforesis capilar.

SUS-PAGE. Volviendo a las proteínas, los geles de poliacrilamida como método rutinario de separar y purificar proteínas o. también, como criterio de pureza y para determinar la masa molecular de estas moléculas, fueron introducidos por Laemmli hace más de 30años. Laemmli también estandarizó las condiciones para separar de forma sistemática proteínas según su tamaño por SDS-PAGE monodimensional (I -D). El rango de separación es aprox. de I hasta 300 kDa. En esta técnica, las proteínas se desnaturalizan por el calor y se tratan con agentes disociantes. El SDS ayuda a esta desnaturalización al tiempo que las solubiliza en micelas y les confiere a todas carganegativa para que emigren al ánodo, independientemente de su punto isoeléctrico (pl). La desagregación de la estructura cuaternaria en subunidades se completa con la presencia de β-mercaptoetanol, que rompe puentes di sulfuro y asegura la obtención de monómeros, para su migración en orden inverso a su masa molecular.

2D-PAGE. Los abordajes proteomicos ambiciosos necesitan tipos deelectroforesis más sofisticadas y de mayor poder de resolución. Entre ellas destaca la electroforesis bidimensional 2D-PAGE, consistente en dos electroforesis consecutivas. En la 2D-PAGE. la primera electroforesis que se realiza es en realidad un isoeletroenfoque, en el que las proteínas sin disociar ni tratadas con detergente se separan según su pl, mediante la aplicación de la muestra en unas tiras quetienen un gradiente de pH inmovilizado (IP, inmovilinas). Al aplicar el campo eléctrico, las proteínas migran y se distribuyen de acuerdo con su pl, hasta alcanzar la zona de pH igual a ese parámetro, puesto que ahí pierden su carga neta y ya no se mueven durante el resto del isoelectroenfoque.

Esa Tira con las proteínas distribuidas según su pl es el punto de partida para la segundaelectroforesis, que consiste en la separación, basada en el tamaño, sobre un gel, según las condiciones de Laemmli. El campo eléctrico se aplica en dirección perpendicular al sentido de la migración de lu tira de isoelectroenfoque, y las proteínas avanzan de Corma inversa a su tamaño.

Inicialmente, las tinciones de los geles finales se realizaban con azul Coomassie, pero se han desarrollado otrasalternativas más sensibles para visualizar proteínas minoritarias, como el nitrato de plata o colorantes fluorescentes, tipo Sypro-Ruby. Cy3, Cy5, entre otros, que permiten una mayor sensibilidad y, sobre todo, compatibilidad con la posterior digestión tríptica de la proteína, necesaria para seguir el proceso de identificación por MS. Además, esos colorantes son de mas fácil eliminación que el azul...