Vete

PROTOCOLO DE EXTRACCION DE DNA moscas, levaduras, bacterias.



1.- A partir del guacamoscas , realizar una suspensión en 500 ml. De tampón delisis, homogenizar y romper las células por fricción mecánica en el vortex durante 10 minutos (se puede dejar 30 minutos en el shaker a 300 rpm atemperatura ambiente

Incubar a baño maría a 65º C durante 1 hora

2.- Añadir 500µl de fenol-cloroformo (4°C) y agitar a 13000 rpm durante 15 min

3.-recoger 350µl de sobrenadante en otro eppendorf nuevo

Añadir 65µl de NaOAC 3M y 75µl de NaCl 1M (si recogemos menos cantidad de sobrenadante, añadircantidades proporcionales de reactivos) agitar suavemente por inversión

4.- Dejar en hielo 30min o más.

5.- Centrifugar a 12 000 rpm durante 10min.Recoger 500µl de sobrenadante en un eppendorf nuevo.

6.-Añadir 0.54 volúmenes de isopropanol (270µl).Dejar en el congelador de -20° C durante 10minutos o más. (toda la noche).

7.- centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min.

8.- eliminar sobrenadante. Añadir 500µl de etanol al 70% y resupender elpellet

9.- centrifugar a 10 000rpm durante 5 min

10.- Eliminar sobrenadante. Secar el vacio (20 min en el speed-back a 50°C.

11.- resuspenderel pellet en 20µl de TE

12.- Tratamiento de RNA asa, añadir 10µl de RNAasa Y DEJAR A 37°C durante 1 hora

13.- Comprobación de DNA Gel (0.8 %agarosa) 2µL de DNA + 2µl de colorante

14.- dejar en hielo aproximadamente 20 min

15.- mezclar con la micropipeta 30 a 40 veces

16.-colocar el gel.