Viabilidad celular.

Viabilidad celular.
Diacetato de Fluoresceina + Yoduro de Propidio.

Introducción. El reconocer células viables vegetales, animales, bacterianas, etc., es importante para su utilización con finesde producción, fertilización, evaluación de la acción de antibióticos y/o para la determinación de células que pueden estar involucradas en procesos de agentes tóxicos o contaminantes. Para evaluar laviabilidad celular, se han propuesto diversos métodos y uno de ellos es mediante el uso de colorantes fluorogénicos como el Diacetato de Fluoresceína (DAF) y Yoduro de Propidio (IP).
Estosmarcadores son moléculas no fluorescentes que pueden servir de sustratos en ciertas reacciones enzimáticas, por lo que tienen un papel fundamental para la identificación de las células. El DAF permitevisualizar el citoplasma de las células vivas de un color verde brillante, este colorante pasa a través de la membrana celular y es hidrolizada por las esterasas intracelulares para producir fluoresceína,que al acumularse induce una fluorescencia verde cuando es excitada con una luz azul. Mientras que el IP atraviesa solamente las membranas celulares de las células dañadas o muertas, ya que las célulasvivas presentan integra su membrana e impiden el paso de este fluorocromo al interior del citoplasma. Cuando una célula presenta daño en su membrana celular, el IP entra en el citoplasma, se intercalacon el ADN y ARN, forma un complejo fluorescente rojo brillante que se observa en el núcleo de las células muertas.

Objetivo. Observar células viables (teñidas de verde) y células muertas (célulasrojas).

Material:
Tubos de ensaye
Portaobjetos
Cubreobjetos
Micropipeta 0.1 – 1 mL
Micropipeta 10 – 100 µL
Isopos

Material Biológico:
Células de epitelio bucal o cultivos celulares.Equipo:
Microscopio de fluorescencia

Soluciones:
PBS (Buffer de fosfatos) – (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM). Ajustar el pH a 7.4.

Diacetato de Fluoresceina (FDA)...