Virología 2010-ii aporte

INTRODUCCIÓN

La hepatitis E está ampliamente distribuida en el nivel mundial; las grandes epidemias han sido reportadas en países en desarrollo de regiones tropicales y subtropicales, de Asia, África y América Latina (México). Epidemiológicamente, la hepatitis E puede presentarse en forma de brotes explosivos de hepatitis viral aguda o como casos esporádicos; esta última es la más común enpaíses industrializados.
El virus de la hepatitis E (VHE) es transmitido por vía fecal-oral, asociado al consumo de agua contaminada. Sin embargo, el riesgo de transmisión zoonótica, ha sido demostrado por varios autores.
El VHE pertenece a la familia Hepeviridae, es el único miembro del género Herpevirus. El virus posee un genoma ARN de simple cadena, de sentido positivo; con una talla de 7,2 kb.Además, cuenta con 3 marcos abiertos de lectura (MAL1, MAL2, MAL3). Hasta el presente ha sido identificado un solo serotipo, pero posee una amplia variabilidad genética, por lo que se agrupa en 4 genotipos (1-4) y diferentes subtipos (a-j). Varios grupos de investigadores han intentado obtener la adaptación del VHE en líneas celulares humanas (A549, 2BS, PLC/PRF/5, LLCMK2, KMB17, BEL7402 y HeLa) yde primates no humanos (Vero y FRhK4). El primer aislamiento se reportó en la línea FRhK4 co-cultivada con células de riñón de mono Cynomolgus infectadas con una suspensión de heces de un paciente con hepatitis E. Además, otros autores detectaron que las líneas celulares 2BS, A549, PLC/PRF/5, LLCMK2 y Vero son sensibles al virus. No obstante, el efecto citopático (ECP) como marcador de replicaciónviral no aparece habitualmente en todos los sistemas celulares estudiados.
MATERIALES Y MÉTODO

Preparación de la Suspensión de Heces
La muestra de heces fue colectada de un paciente cubano (ECV/2349-03) con diagnóstico clínico y serológico de hepatitis E; en los primeros 15 d después del inicio de los síntomas y la elevación de las aminotransferasas. El espécimen fue conservado a - 70 °Chasta su uso. La suspensión se preparó a 10 % con medio esencial mínimo (MEM) libre de suero fetal bovino (SFB) y suplementado con ampicillin (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/mL). Inmediatamente, fue homogenizada con vortex y luego clarificada por centrifugación a 2 000 g, durante 15 min a temperatura ambiente.
Cultivo Celular
Para el aislamiento y la propagación del VHE se utilizaron lascélulas A549 (línea celular de carcinoma de pulmón humano). Estas proliferaron en frascos plásticos de 25 cm2 a 37 ºC, hasta que la monocapa llegó a ser subconfluente. Para el crecimiento de las células se empleó medio esencial mínimo Dulbecco modificado, suplementado con SFB 10 %, ampicillin (100 UI/mL) y estreptomicina (100 µg/mL). Las células MRC5 (línea diploide de fibroblasto de pulmón humano);HEP-2 (línea de carcinoma epidermoide de laringe humano); LLCMK2 (células epiteliales de riñón de mono rhesus); FRhK4 (derivada de fibroblasto de riñón de mono rhesus) y la HeLa (células epiteliales humanas de carcinoma cervical) fueron empleadas para la propagación viral. Las líneas celulares antes referidas utilizaron MEM, excepto las células FRhK4 que crecieron con medio Dulbecco, suplementado conSFB 10 %, ampicillin y estreptomicina con las concentraciones antes referidas.

Aislamiento y Propagación del Virus
Para aislar el virus en A549, el medio de crecimiento se decantó y se inoculó la monocapa con 0,5 mL de la suspensión de heces, la que se mantuvo en contacto con las células durante 1 h a 37 ºC. Transcurrido el tiempo, se completó con medio de mantenimiento (MEM, 2 % SFB,antibiótico) y las células fueron observadas con el microscopio óptico de 9-11 d. Cuando el ECP llegó a ser de 3 cruces (75 % de la monocapa afectada) los frascos fueron congelados. Para los pases las células y el sobrenadante se sometieron a 3 ciclos de congelación y descongelación con el propósito de liberar el virus intracelular, luego se clarificó el sobrenadante y se inoculó en la nueva monocapa....