Visualizacion De Acidos Nucleicos Por Electroforesis

VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS


RESUMEN

La experiencia realizada tuvo como objetivo visualizar mediante electroforesis en gel de agarosa extractos de ADN para adquirir destreza en la preparación de geles de agarosa y la siembra de muestras para realizar electroforesis. Para esto fue necesario preparar el gel de agarosa en el que se correría las muestras de ADNobtenido durante experiencias realizadas con anterioridad. De igual manera fue necesaria la preparación de un búfer de corrido. Para poder visualizar el ADN, terminada la electroforesis, se adiciono con antelación sybr safe para que este le confiriera el carácter fluorescente que se observa finalizada la experiencia. Se pudo notar que hubo muchas diferencias en los resultados obtenidos por cada grupo detrabajo por lo que no es posible hablar de manera concluyente. No sobra decir que la electroforesis es una buena técnica de visualización de ácidos nucleicos si se realiza de manera exitosa la extracción y montaje de dichas moléculas.
Palabras claves: electroforesis, búfer de carga, fluorescencia, cargas eléctricas, fotodocumentador.



INTRODUCCIÓN
La concentración e integridad del ADNextraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculasen un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim 2008).
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediantetinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin embargo, éste es unreactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
La técnica para la cuantificación de ADN consiste simplemente en lautilización de una secuencia de concentraciones de solución patrón de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre unafotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes (Posso y Ghneim op cit.).
La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del ADN total (proveniente de una extracción de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y avoltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de 100pb a 500pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados más rápido...