Vitaminas En Premix



TA - 07

DETERMINACION DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES COMPLEJO B y VITAMINA C
EN PREMEZCLAS VITAMINICAS POR HPLC.






1. FUNDAMENTO

El método se basa en la extracción simultanea de las vitaminas del complejo B Tiamina, Riboflavina, Piridoxina, Niacina, Ac. Fólico y cianocobalamina con solución extractante salina, y posteriormente analizada por LC/UV a las longitudes de onda de 204 y 265nm.También se analiza acido ascórbico (vitamina C) en las mismas condiciones cromatográficas, excepto la longitud de onda que es 255 nm y la extracción de la muestra




2. ALCANCE Y APLICACIÓN

Este método tiene como alcance la determinación de vitaminas hidrosolubles del complejo B y vitamina C. Es aplicable a muestras de premix y materias primas














3. MATERIALES Y EQUIPOS

a.Materiales
- Tubos de vidrio de 16x125 mm con tapa
-Tubos de centrifuga de 50 ml
-Pipetas de aforo de 3 ml
-Pipeta de aforo de 25 ml
-Probeta de 1000 mL
-Vaso precipitado de 250 y 1000 mL
-Viales para autosampler de 1.8 mL con tapa
-Gradilla tubos de vidrio
-Filtro de membrana 0.22um
b. Equipos

-Balanza analítica con precisión de 0.1 mg
-Baño ultrasonido
-Vortex
-Cromatógrafo Líquido equipadocon:
-Detector UV
-Autosampler
-Horno termorregulado
-Bomba con 4 canales
-Columna analítica C18 250 x 4.6 mm Shodex C18-4E










4. REACTIVOS Y SOLUCIONES

4.1 Reactivos

4.1.1 Fosfato acido di-potasio trihidratadoK2HPO4*3H2O
4.1.2 Agua desionizada
4.1.3 Metanol calidad HPLC
4.1.4 Acido Fosfórico, 85%
4.1.5 Acido metafosforico
4.1.6 Ditiotreitol
4.1.7 Estándar de Tiamina (B1)con certificado de lote y de pureza
4.1.8 Estándar de Piridoxina (B6) con certificado de lote y de pureza
4.1.9 Estándar de Niacinamida (B3) con certificado de lote y de pureza
4.1.10 Estándar de Riboflavina (B2) con certificado de lote yde pureza
4.1.11 Estándar de Ac. Pantotenico (B5) con certificado de lote y de pureza
4.1.12 Estándar de Ac. Fólico (B9) con certificado de lote y de pureza
4.1.13 Estándar de Cianocobalamina (B12) con certificado de lote y de pureza

4.2 Soluciones

4.2.1 Solución extractante

-K2HPO4*3H2O 0.1 M: Pesar 22.82 g de K2HPO4*3H2O en vaso pp de 1 L y disolver en 500 ml agua millipore hasta totaldisolución de la sal.
Enrasar a 1 L con agua millipore y homogeneizar en agitador magnético.

-Acido metafosforico al 1% con 0.2 % de ditiotreitol: Pesar en vaso pp de 250 ml, 10 g de acido metafosforico y 2g de ditiotreitol.Traspasar cuantitativamente a un vaso de 1000 ml y disolver en 500 ml de agua desionizada , aforar a 1000 ml y homogeneizar en agitador magnético.

4.2.2 Solución Fasemóvil

Fase móvil A: fosfato tribásico 50 mM a pH 2.5 /metanol (90/10)
Fase móvil B: fosfato tribásico 50 mM a pH 2.5/metanol (10/90)

-Fosfato tribásico 50 mM: Pesar 8.197 g de fosfato tribásico Na3PO4 en vaso pp de 1L, disolver en 500 ml de agua millipore y aforar a 1L. Ajustar a pH 2.5 con acido fosfórico concentrado.

- Fase móvil A: En probeta de 1L, mezclar 900 ml de solución de Na3PO4 50mM,con 100 ml de metanol. Homogeneizar y sonicar durante 5 minutos.

-Fase móvil B: En probeta de 1L, mezclar 100 ml de solución de Na3PO4 50mM, con 900 ml de metanol. Homogeneizar y sonicar durante 5 minutos.


5. CONDICIONES CROMATOGRAFICAS

Columna : Shodex C 18 – 4E
4,6 mm x 250 mm
Caudal : 1 ml / min.
Volumen de inyección: 20 uL
Gradiente:desde 0% fase móvil B hasta llegar a 70 % en 20 minutos.
Detector : Espectrofotómetro de longitud de onda variable fijada a 265 nm y con la siguiente programación:

Tpo (min) λ (nm)

0 265
6 265
7 204
10 204
11 265
18 265


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