Wester Blot

Western Blot
El Western Blot es una técnica que identifica proteínas específicas obtenidas de una muestra o extraídas de un gel de poliacrilamida después de su separación por electroforesis.
Después de la obtención de los lisados celulares y una vez realizada la cuantificación de proteínas, para conocer la concentración necesaria para detectar la presencia de CYP1B1 (para esta proteína sonnecesarios 20 microgramos de proteína) se preparan las muestras.
Preparación de la muestra
Una vez ajustado el volumen necesario de cada alícuota para obtener los 20µg de proteína, se ponen en un tubo nuevo 5 µl del Buffer de Carga (Laemmli Sample Buffer + 5% de Betamercapto etanol), el volumen necesario de cada alícuota y se lleva a un volumen final y estándar para todas las muestras con Tris10mM. Por ejemplo:
5 µl del B.C. + 10 µl de mi alícuota CT + 5 µl de Tris 10Mm
5 µl del B.C. + 12 µl de mi alícuota DMSO + 3 µl de Tris 10Mm
El volumen final para todas mis muestras son 20 µl.
Una vez preparadas las muestras se calientan por 10 min a 90°C en el Termo Block (calentar 10 min antes de usarlo). Una vez transcurrido este tiempo centrifugar en la micro centrifuga para hacer bajarel vapor de las paredes y recuperar la muestra completa.
Preparación de Geles PAGE-SDS
El porcentaje de concentración de los geles depende del peso de la proteína que buscamos en el caso de CPY1B1 es de 56KDa por lo que es necesario un gel al 12%. La manera de prepararlo se describe a continuación:
Limpiamos en los cristales de 1mm y los montamos de manera correcta en el sostén para hacer losgeles.
Para el gel separador (donde se separan las proteínas de acuerdo a su peso) en un vaso de precipitados agregamos:
* H2O DD: 3.350ml
* Tris 1.5M pH 8.8: 2.500ml
* SDS: 100 µl
* Acrilamida: 4ml
* APS 10% : 50 µl
* TEMED: 5 µl
Se agrega 200 µl de isopropanol para desgasificar el gel.
Esta mezcla la ponemos en el espacio entre los cristales y la dejamospolimerizar durante 20 min aprox.
Se limpia el isopropanol con papel absorbente.
Una vez polimerizada se hace el gel concentrador al 5% (donde se colocan las muestras):
* H2O DD: 1.430ml
* Tris 0.5M pH 6.8: 620 µl
* SDS: 25 µl
* Acrilamida: 400 µl
* APS 10% : 10 µl
* TEMED: 5 µl
Se pone el peine y se deja polimerizar durante 5 min aprox.
Una vez polimerizado seretira el peine y se limpia el exceso de acrilamida con papel absorbente, el gel se pone en la cámara de electroforesis como ahí se indica y se agrega el Buffer de Corrida.
En el primer carril se carga el marcador de peso molecular (20 µl), y en los carriles subsecuentes se cargan las muestras que se prepararon previamente (20 µl), se corre el gel a 150 volts durante una hora aproximadamente ohasta que el marcador se encuentre lo suficientemente separado.
Transferencia de proteínas
La transferencia es la migración de proteínas a través de la aplicación de carga eléctrica del gel hacia la membrana.
Primero se humedecen dos esponjas con el Buffer de Transferencia, sobre un cristal se pone una de las esponjas que humedecimos, después se pone la membrana (las membranas también sonseleccionadas de acuerdo al peso molecular de la proteína, en el caso de CYP1B1 es necesaria la membrana de nitrocelulosa) después de colocar la membrana, de un solo movimiento se pone el gel de tal manera que queden perfectamente apareados, con una pipeta o espátula se quitan las burbujas las cuales pueden obstruir la correcta transferencia de las proteínas, encima de esto se coloca la otra esponja yse quita el exceso de buffer. El producto final es un sándwich, el cual se coloca en medio de la cámara de transferencia, una vez colocado ahí, se cierra la cámara y se conecta a una fuente de poder a 120 volts durante 1hora.
Correcta transferencia
Una vez transcurrido este tiempo se saca el sándwich de la cámara, el gel se debe teñir en Azul Comassic, la membrana se debe teñir con rojo...