Western blod

INMUNOLOGÍA DIAGNÓSTICA
WESTERN BLOT
INTRODUCCIÓN
El western blot es un método en biología molecular/bioquímica/inmunogenética para la detección de proteínas en función de su capacidad para unirse a anticuerpos específicos.
Western blot puede detectar su proteína del interés de una mezcla de un gran número de proteínas. Western Blot le puede dar información sobre el tamaño de su proteína (conrespecto a un marcador de tamaño o escala en kDa), y también le dará información sobre expresión de la proteína (con respecto a un control como muestra no tratada o de otro tipo de célula o tejido.
Western blot puede analizar cualquier muestra de la proteína ya sea de células o tejidos, y también puede analizar las proteínas recombinantes pueden sintetizar in vitro.
Western blot depende de lacalidad de los anticuerpos que se utiliza para la sonda de su proteína del interés, y cómo es específica para este proteínas.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
* Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes demuestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.[7]
* Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden proteasas e inhibidores defosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas, respectivamente.[8]
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4ºC) para evitar la desnaturalización proteica. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas
Electroforesis en gelLas proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel depoliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las proteínas noinfluye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en elWestern blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):
* las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófóba.
* en las membranasde PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también más frágiles, tienden a tornarse...