western blot

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON


FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS


DIAGNOSTICO MOLECULAR


Western BLOT








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IVAN DANIEL VALLEJO VALDEZ
1612845




Monterrey,NL. a 15 de Octubre del 2013
INTRODUCCION
Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos y de anticuerpos específicos, las proteínas son separadas mediante electroforesis verticalen geles de poliacrilamida y migran del polo (-) al (+) por el efecto del SDS que las desnaturaliza y les otorga una carga neta (-) después ya que termino de correr el gel se transfierenperpendicularmente a una membrana con la aplicación de un campo eléctrico. La proteína especifica puede ser identificada y visualizada empleando técnicas de inmunodeteccion comúnmente se usa un anticuerpo primariopara detectar la proteína y después se agrega un anti-anticuerpo secundario conjugado con el fin de producir una señal detectable. Esta técnica es el estudio confirmatorio mas empleado para eldiagnostico del SIDA.
METODOLOGIA
SDS-PAGE
1.Gel preparado staking 4% y gel running 11% de acrilamida
2.15 µl de proteína M1 de influenza mezclada con el buffer de carga SDS y B-19 azul debromofenol.
3.Electroforesis a 15 miliampers constantes por 1.5 horas
4.Teñir el gel con azul de comassie.
TRANSFERENCIA
1.Se prepara el sándwich:
-Esponja
-papel filtro evitando la formación deburbujas
-Gel PA evitando la formación de burbujas
-Membrana evitando la formación de burbujas
-Papel filtro
-Esponja
2. Llenar cámara de transferencia con el buffer de corrimiento e introducir elsándwich.
3. Transferencia a 60 volts constantes por hora.
INMUNOBLOTING
1.Lavar la membrana 1 vez con TBS s/twin pH=7.5
2.Adicionar solución bloqueadora (albumina bovina 1% diluida en TBS-T) y seincuba 30 min
3.5ml de suero problema de conejo diluido 1:6000 en TBS-T y se incubo a 4°c toda la noche.
4.Retirar el suero y lavar 3 veces 5 minutos c/u com 15 ml TBS-T
6.Se preparo el conjugado...