Western Blot

Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela de Bioquímica
Laboratorio de Bioquímica II (BIO 361)

“LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II”

Informe Nº3: Western Blot



Profesores : Verónica García Mena
Samuel Parra Aguilar

Carrera : Bioquímica

Curso : BIO-361 LA

Sección : 1

Fecha de entrega: 23 de noviembre de 2011

INTRODUCCIÓN

La purificación deproteínas por medio de técnicas cromatográficas es un eficiente método de obtener fracciones de una proteína para poder realizar un posterior análisis de ellas. Una forma de llevar a cabo estos análisis es por medio de la técnica llamada Western Blot. El Western Blot es una técnica comúnmente utilizada para la verificación de la presencia de proteínas de interés en un extracto crudo. Además, estatécnica es usada como una herramienta cualitativa, es decir, para determinar si una proteína en particular está presente. Este método también puede ser utilizado para cuantificar la cantidad de proteína presente en una solución pura o impura. Otra aplicación que se le puede atribuir es que puede ser usado para detectar cualquier proteína de interés, provisto de un anticuerpo contra la proteína deinterés [1].
Figura. 1. Representación esquemática de la técnica de Western Blot (Switzer, Experimental Biochemistry)
El procedimiento general de esta técnica, se muestra en la Figura 1. Para llevar a cabo ésta primero que todo se debe separar las proteínas de un extracto crudo mediante SDS-PAGE. Luego de ello, las bandas proteicas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa por mediode una diferencia de voltaje. En el momento en el que se aplica el campo eléctrico, las proteínas migran fuera del gel de poliacrilamida hacia la superficie de la membrana, donde quedan fuertemente adheridas, por lo que la membrana de nitrocelulosa se transforma en una copia exacta del patrón de proteínas que se tenía en el gel de poliacrilamida. Hecha la transferencia a la membrana, se procede arealizar el bloqueo de ésta. En esta técnica es importante bloquear los sitios de unión de la membrana que quedaron sin reaccionar con la proteína, ya que así se reduce la unión inespecífica de los anticuerpos que luego se emplean en los siguientes pasos. Las soluciones de bloqueo van desde el empleo de leche hasta suero normal, llegando incluso a la utilización de proteínas altamente purificadas[2].
Posteriormente, esta membrana es puesta en contacto con anticuerpos específicos para la proteína en estudio. Dicho anticuerpo reconocerá epítopes presentes en la proteína y posteriormente, será reconocido por otro anticuerpo llamado anticuerpo secundario, el cual es capaz de reconocer la porción Fc (porción constante) de las inmunoglobulinas. Además, este anticuerpo secundario seencontrará marcado con alguna molécula que permita luego la detección del conjunto [1,3]. Otro aspecto importante a considerar son la saturación o bloqueo de la membrana, la cual se realiza con agentes bloqueadores que son capaces de interaccionar de forma no específica con los sitios desocupados de la membrana.
Finalmente, para poder llevar a cabo la detección de las proteínas presentes en el ensayo,se pueden considerar dos formas de realizar esta detección. Una manera es por medio de un método quimioluminiscente, método donde se aprovecha los fotones producidos por sucesivas reducciones y oxidaciones de compuestos tales como el luminol y la peroxidasa, los cuales luego se pueden observar por medio de film fotográfico. Otra forma de poder obtener la detección proteica es por medio de un métodocolorimétrico, tal como la precipitación de elementos presentes en la membrana que reaccionan de distintas formas según sea el reactivo químico utilizado [4]. A continuación, se muestra en la Tabla N°1 una serie de enzimas y sustratos que se pueden utilizar para obtener el precipitado

Tabla N°1. Enzimas y Sustratos utilizados para la reacción de precipitación colorimétrica empleadas para...