western blot

WESTERN BLOT
Es una técnica analítica que implementa gel de electroforesis para detectar proteínas desnaturalizadas específicas en una muestra determinada. Las proteínas son trasferidas desde elgel hacia la membrana (originalmente de nitrocelulosa), donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para dicha proteína.
PROCEDIMIENTO:
a) Preparación de la muestra: Extracción de lasproteínas de la muestra mediante disrupción mecánica o química.



b) Electroforesis en gel de Acrilamina: Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Seprepara un gel de acrilamina, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativaa cada una de ellas.

c) Transferencia electroforética a una membrana: las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana donde quedan inmovilizados.

d)Hibridación del anticuerpo: La membrana con las proteínas inmovilizadas deben tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
Acontinuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá deforma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección.


e) Detección de las bandas: Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se procedea detectar la localización de la banda de membrana. Para la detección de quimioluminiscencia. Se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP); la adición de un sustratoprovoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captación de...