WESTERN BLOT
Páginas: 33 (8021 palabras)
Publicado: 1 de abril de 2014
Análisis de Proteínas
Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección
advansta
Análisis de Proteínas
Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta
Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permitela detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.
Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación,
y ser utilizadopara comparar cuantitativamente los niveles
de proteína entre muestras.
Esta guía de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realización de un Western
blot, incluyendo la preparación de muestras,
la separación de proteínas, la transferencia y
la detección.
Índice de Contenidos
Página
1. Western Blot: Visión General
2
2. Preparación de las muestras
4
3.Electroforesis en gel de Poliacrilamida
5
4. Transferencia Electroforética
11
5. Hibridación Anticuerpos
13
6. Detección
15
7. Solución de Problemas
17
8. Herramientas y Referencias Técnicas
21
1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.76(9):4350-4.
Página 1
Western Blot:
Visión General
1. Western Blot: Visión General
Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.
a. Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o
química.
Los materiales de partida incluyen
planta, tejidos animales, células
cultivadas, levadura, obacterias.
La disrupción mecánica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamiento subcelular
Se usan tampones conteniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparación de muestras
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las proteínas en el extracto se
separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis.
Se prepara un gel deacrilamida, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada proteína, una carga
negativa a cada una de ellas.
Se añade un colorante de carga. Así, la
migración de la muestra se puede monitorizar.
Se utiliza una pipeta para
cargar las muestras en los
pocillos del gel
Una fuente de alimentaciónproporciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampón,
que conducirá la corriente. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
c. Transferencia electroforética a una membrana
Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.
El gel yla membrana se coloca
entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..
Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las proteínas migran desde
el gel a la membrana.
Un cartucho aplica presión y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana
Página 2
Análisis de Proteínas
a. Hibridación del Anticuerpo
Lamembrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y
así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana.
Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado
que se unirá de forma específica al...
Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección
advansta
Análisis de Proteínas
Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta
Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permitela detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés.
Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación,
y ser utilizadopara comparar cuantitativamente los niveles
de proteína entre muestras.
Esta guía de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realización de un Western
blot, incluyendo la preparación de muestras,
la separación de proteínas, la transferencia y
la detección.
Índice de Contenidos
Página
1. Western Blot: Visión General
2
2. Preparación de las muestras
4
3.Electroforesis en gel de Poliacrilamida
5
4. Transferencia Electroforética
11
5. Hibridación Anticuerpos
13
6. Detección
15
7. Solución de Problemas
17
8. Herramientas y Referencias Técnicas
21
1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.76(9):4350-4.
Página 1
Western Blot:
Visión General
1. Western Blot: Visión General
Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.
a. Preparación de la muestra
Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o
química.
Los materiales de partida incluyen
planta, tejidos animales, células
cultivadas, levadura, obacterias.
La disrupción mecánica
con un homogenizador
disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamiento subcelular
Se usan tampones conteniendo detergentes
para la lisis celular
Figura 1. Preparación de muestras
b. Electroforesis en gel de
Acrilamida
Las proteínas en el extracto se
separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis.
Se prepara un gel deacrilamida, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
de cada proteína, una carga
negativa a cada una de ellas.
Se añade un colorante de carga. Así, la
migración de la muestra se puede monitorizar.
Se utiliza una pipeta para
cargar las muestras en los
pocillos del gel
Una fuente de alimentaciónproporciona el voltaje
El gel se coloca dentro de un tanque
de electroforesis lleno de tampón,
que conducirá la corriente. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo.
Figura 2. Electroforesis en Acrilamida
c. Transferencia electroforética a una membrana
Las proteínas son transferidas
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.
El gel yla membrana se coloca
entre papel de filtro y almohadillas
de esponja..
Se aplica voltaje en el
tanque de transferencia y
las proteínas migran desde
el gel a la membrana.
Un cartucho aplica presión y
mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.
Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana
Página 2
Análisis de Proteínas
a. Hibridación del Anticuerpo
Lamembrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y
así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana.
Tras varios lavados de la membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado
que se unirá de forma específica al...
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