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Síntesis de biomasa o proteína de origen unicelular de Saccharomyces exiguus en ácido acético.
Materiales y Métodos
ORIGEN DE LA LEVADURA
La cepa de Saccharomyces exiguus se aisló de aguamiel (Agave sp) y se identificó por Saldaña (22); pertenece a la colección del laboratorio de microbiología industrial y del suelo del área de microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas UANL, de dondese obtuvo para la realización de este trabajo.
II CONSERVACIÓN
La levadura fue mantenida por resiembra periódica mensualmente en agar Sabouraud glucosa al (p/v) 2%, (Merck) pH 5, a temperatura de refrigeración y agar acetato diferencial (Difco), pH6 y 7.
III MEDIO DE CULTIVO
Se probaron dos medios base denominados M-I y M-II
a) El medio M-I contenía: (g/L) NH42S04 (Reactivos Monterrey) 4.0;KH2PO 4 (Merck) 0.8; MgSO J H20 (Merck) 0.25; agua de la llave 1000mL; extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, Y 5 %; v/v pH final 4.5 ajustado con NaOH concentrado con potenciómetro.
b) El medio M-II contenía: (g/L) NH4Cl (Reactivos Monterrey) 5.0; KH2PO4 (Merck) 5.0, MgSO4.7 HP (Merck) 2.5; CaCl2. HP (Baker) 0.8; agua de la llave 1000mL;extracto de malta (Merck) 30 ppm. AA (Reactivos Monterrey) en concentración de 1, 2, 3, 4, y 5 (%); pH de 4.5 ajustado con NaOH.
IV CONDICIONES DE FERMENTACIÓN
a) Se realizaron experimentos en matraces Erlenmeyer de 500ml con 100ml del medio de cultivo en un agitador mecánico 250 rpm (Eberbach), a temperatura ambiente con un tiempo de fermentación de 96-120h, se seleccionó la mejor concentración de AApara la producción de levadura en base a su rendimiento y se escalonó a nivel de microfermentador M F-114 (New Brunswick Scientific Co. Inc.) con capacidad de 14L agitación de 300-500 rpm temperatura 30°C, aeración de 1 VVM, con dos antiespumantes; antifoam (Sigma) y el Dow corning FG-10 (Siliconas), se usó 1 mi del antiespumante concentrado al iniciar la fermentación y luego se diluyó al 10 % enagua destilada como acarreador durante la fermentación.
b) Preparación del inóculo. Para los experimentos en matraces Erlenmeyer se preparó una suspensión de S. exiguus en solución salina 0.85% estéril a partir de un cultivo de 48h, crecida en agar Sabouraud glucosa 2%, se tomaron 5ml para cada matraz hasta alcanzar una absorbancia de 0.60 a una longitud de onda de 650m en un espectrofotómetroColeman júnior 11 en celdas de 5mm de diámetro y 2.5ml de capacidad. Para los experimentos en el microfermentador se emplearon dos matraces de 1000ml; con un volumen de medio de cultivo de 350ml la levadura se activó de la manera mencionada hasta alcanzar 0.60 de absorbancia con estos 700ml se inocularon los 7.7L del medio de cultivo para el microfermentador.
V CINÉTICA DE FERMENTACIÓN
Losprincipales parámetros considerados para establecer la cinética de fermentación de S. exiguus en AA y sales minerales además del extracto de malta fueron: densidad óptica, peso seco (g/L) y pH.
a) Densidad óptica.
Se tomaron muestras cada 0, 24, 48, 72, y 96h para los matraces y 2, 3, o 4h, para los experimentos en el microfermentador se colectaron 4ml del medio de cultivo para las lecturas a unalongitud de onda de 650nm. En un espectrofotómetro Coleman júnior 11.
b) Determinación del peso seco.
Para el peso seco se usaron membranas milipore de 25m m de diámetro (Gelman) de 0.2 micras de diámetro se llevaron a peso constante en un horno a 11 OOC/18h, después se depositaron en un portafiltros con una jeringa hipodérmica adaptada y se filtró 1 mi del medio de cultivo, se lavaron las célulascon 2ml de solución salina al 0.85 % Y se secaron a 40°C. Las membranas se llevaron a peso constante en el horno a 11 OOC/18h. El pH se determinó con un potenciómetro Corning Scientific Instruments Mod.5.
c) Coeficiente de rendimiento del sustrato.
Se calculó en base a la ecuación y = X/S donde x representa los gramos de peso seco de la levadura IL de medio de cultivo y s los gramos de AA/L...