T Cnica De Separaci N De Prote Nas SDS Page



Técnica de separación de proteínas SDS page (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)

Es una técnica que permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína, comparando su movilidad electroforética con la de proteínas de PM conocido. Estas determinaciones poseen un margen de error de ∼ 10%. La determinación del PM de proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando seanalizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su interacción con el SDS. Bajo estas condiciones, la migración de las moléculas obedece fundamentalmente a su PM. No obstante, en ocasiones es útil analizar muestras no reducidas de una proteína, por ejemplo, para evaluar su composiciónde subunidades. En tal caso, la movilidad electroforética en SDS-PAGE, aunque guarda una cierta relación con el PM, no necesariamente corresponde con su PM exacto, dependiendo de la forma y los pliegues causados por los enlaces disulfuro, que seguirían intactos aún después de la interacción SDS-proteína, en condiciones no-reductoras.

Características del método

+Presencia de Sodio Dodecil Sulfatobajo condiciones reductoras (SDSPAGE)
+Método rápido, reproducible y de bajo costo
+Utilizado para cuantificar, comparar y caracterizarproteínas
+Técnica analítica semipreparativa : se separan biomoléculas según su tamaño molecular bajo la acción de un campo eléctrico. (Laemmli 1.970).
+Permite separar proteínas haciéndolas pasar por un gel o resina: bisAcrilamida, la cual es un agenteentrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adherirán las proteínas.
+La separación electroforética se realiza en condiciones desnaturalizantes, al añadir compuestos que alteren las condiciones nativas de las proteínas y que se agrupan en una solución denominada: tampón de carga.

Preparación de geles para SDS-PAGE (Laemmli, 1970).

Las cantidades que se describen a continuación sirven para elsistema de minigeles de Bio-Rad (Mini-Protean II). Las mismas pueden adaptarse para otras cámaras de diversa capacidad, conservando las proporciones.

Para la preparación del gel separador o inferior (5 ml, grosor = 0,75 mm), mezclar los siguientes reactivos, según el porcentaje de gel deseado, en un frasco Kitasato de 50 ml:






2. Preparar el molde para el gel. Hacer una marca a ∼1-1,5 cmdebajo del nivel del "peine"de muestras. Retirar el peine.

3. Con la mezcla de reactivos a temperatura ambiente, desgasear aplicando vacío por 15 min.

4. Iniciar la polimerización agregando 3 μl de TEMED y 15 μl de persulfato de amonio a la mezcla. Inmediatamente mezclar y verter la solución en los vidrios (molde), hasta la marca hecha en el paso #2, sin atrapar burbujas. De seguido, eliminar lacurvatura (menisco) en la superficie, con una delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol, depositada muy suavemente sobre la mezcla. Dejar que polimerice el gel (óptimamente en 15-20 min).
5. Una vez que la interfase entre el polímero y el agua se torna visible, esperar 10-15 min adicionales para que se complete la reacción. Luego, decantar el exceso de líquido de la superficie, ycolocar el peine para muestras, en posición ligeramente inclinada (para no atrapar burbujas).
6. Mezclar los componentes del gel superior (compactador):








7. Una vez agregados los catalizadores, mezclar y verter de inmediato en el molde, nivelando ahora el peine a su posición horizontal, sin atrapar burbujas. Dejar polimerizar.

8. Quitar el peine deslizándolo suavemente, y lavar los hoyosllenándolos con agua y aspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados.

9. Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado reducido o no reducido mezclándolas con el respectivo amortiguador de muestras. Si las muestras son sólidas, se pueden disolver directamente en el amortiguador "1x". Si son líquidas, se mezclan partes iguales de muestra y...