T CNICAS DE BIOLOG A MOLECULAR

Procedimiento para extracción de ADN:
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, porejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
• tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);
• digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar lasnucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.
Métodos de purificación
Los métodos empleados parapurificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:
• extracción/precipitación;
• cromatografía;
• centrifugación;
• separación por afinidad.
Extracción/precipitación
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol ycloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla Extracción y Purificación de ADN 5 Análisis de la presencia de organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos de un portador inerte (como el glucógeno) parafavorecer la precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.

Cromatografia
Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La permeación sobre gel aprovecha laspropiedades de las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en lainteracción electrostática de la molécula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo, salescaotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.
Centrifugacion
La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsClcon fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño. Algunos...