Aislamiento y Caracterización De Adn Plasmidial

Aislamiento y Caracterización de ADN plasmidial recombinante pET-15b de Escherichia coli BL-21 DE
Sebastián González Mera
Instituto de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia

Resumen.
En el presente trabajo se utilizaron técnicas en ingeniería genética, utilizando la tecnología del DNA recombinante, donde se puede insertar un DNA foráneo al interior deuna célula receptora, para que esta lo exprese como si fuera propio. Este tratamiento se realiza mediante el uso de enzimas de restricción, bacterias hospederas del plásmido y vectores de clonación, se aisló la secuencia de DNA codificante de la fructosa 1.6 bifosfato (fbpas) de riñón de cerdo, una enzima de la vía de glucolisis y gluconeogenesis, esta secuencia se inserto al vector de clona mientopet 15b, mediante el uso de enzimas de restricción que cortan el vector e introducen el gen. Luego de una incubación de las células con el vector incorporado y mediante las enzimas de restricción podemos separar el gen del vector y este ultimo para posteriormente separarlos por electroforesis y determinar si realmente fue insertado el gen y a su vez determinar su tamaño.

Introducción
Latecnología del DNA recombinante es la técnica que ha permitido introducir DNA foráneo dentro de una célula y que lo exprese como si fuera suyo, el DNA recombinante es una molécula artificial creada in vitro por la unión de secuencia de DNA de organismos distintos o también artificiales como por ejemplo los vectores de clonación que son moléculas creadas para el fin de clonar fragmentos de DNAcodificante, el DNA plasmidial es una moléculas de DNA circular extra cromosómica que se replica autónomamente y se encuentra en las células bacterianas, es un vector de clonación in vivo. Un vector plasmidial tiene que tener en su secuencia un origen de replicación (ori), también hay que considerar que esta secuencia de DNA, debe tener al menos un gen marcador seleccionable, normalmente es un gen que leconfiere resistencia a algún antibiótico como la ampicilina. La célula sin este gen de resistencia no podrá sobrevivir en un medio de cultivo que contenga este antibiótico, solo las células que hayan integrado el plásmido pueden sobrevivir en ese medio de selección.
En nuestro trabajo se utilizo el vector pET-15b, el cual contiene 5708 pb contiene un gen que le otorga resistencia a ampicilinaa las células portadoras y otro gen que es utilizado como marcador seleccionable que codifica para la b- galactosidasa, también contiene una secuencia ori que corresponde al origen de replicación, así como de una variedad de sitios de restricción que permiten insertar fragmentos de DNA foráneo (fig. 1). Este plásmido permite la expresión de proteínas de fusión con cola de histidina la queposibilita una veloz separación por medio de cromatografía de afinidad.

Fig. 1. Mapa físico del vector pET15-b.
A 260nm | A 280nm | C. ug/ml | factor | C.final ug/ml |
1,328 | 0,724 | 66 | 200 | 13200 |
El inserto del DNA foráneo que utilizamos, es la secuencia codificante de la fructosa 1,6 bifosfatasa, enzima que cataliza la reacción de tipo escisión aldolica reversible de la fructosa1,6-bifosfato en gliceraldehido-3-fosfato, y dihidroxiacetona fosfato, y de esa manera, participa tanto en la vía glucolitica como en la gluconeogenica, esta secuencia de DNA de FBPasa se inserta en el vector de clona miento pET15 b entre los sitios de corte para enzimas de restricción BamHI y NdeI.
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción tienen la capacidad de reconocer secuenciasespecificas de DNA y las cortan en los enlaces fosfodiester del DNA foráneo, ya que el DNA de la propia célula esta metilado y las enzimas de restricción cortan el DNA pueden dejar extremos romos que son cuando los enlaces fosfodiester cortados por la enzima coinciden en las dos hebras de DNA y extremos cohesivos que son cuando queda un extremos protuberante ya sea en el extremo 5´ o en el 3´....