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Purificación de RNA
IG 2010

1

Purificación de RNA
• ¿Para qué sirve?
• ¿Cómo se trabaja con RNA?
• Pasos generales:
– Homogeneizar células
– Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
– Cuantificar el RNA purificado
– Calidad del RNA
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Purificación de RNA
• ¿Para qué sirve?
• ¿Cómo se trabaja con RNA?
• Pasos generales:
– Homogeneizar células
– Purificar el RNA (total ono total, ej mRNA)
– Cuantificar el RNA purificado
– Calidad del RNA
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Usos del RNA purificado
• Para identificar un RNA en particular, dentro
de la población total de RNA de la célula
– Northern blot
– RPA (RNase protection assay)
– RT-PCR (transcripción reversa y posterior
PCR)
• Otras cosas: traducción in vitro, construcción
de cDNA library, etc.
4

1- Northern blot
• Lasonda es
complementaria
al RNA que se
busca
• Es un método
lento y
semicuantitativo
• Se “ve” el
tamaño del RNA
de interés
5

2- RPA o ensayo de protección
de ribonucleasas
1. La sonda es complementaria al RNA
que se busca. Hibridación
2. Digestión con RNasa: degrada simple
cadena, se protege RNA de interés
(doble cadena con la sonda)
3. Corrida electroforética

•
•

Másrápido y cuantitativo (relación 1 a
1 sonda-RNA) que NB
No se “ve” el tamaño del RNA de
interés (depende de la sonda)
6

3- RT-PCR
1.
2.

3.
•

Transcripción reversa
(RT): de RNA a cDNA
PCR: con primers
específicos se puede
amplificar una región de
interés
Corrida electroforética
El producto de PCR
indica presencia del
RNA de interés
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Purificación de RNA
• ¿Para quésirve?
• ¿Cómo se trabaja con RNA?
• Pasos generales:
– Homogeneizar células
– Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
– Cuantificar el RNA purificado
– Calidad del RNA
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Manipulación del RNA
• El RNA es degradado por
RNasas, que están por todos
lados.
• Las RNasas son mucho más
“poderosas” que las DNasas:
– Son termorresistentes en gral
(autoclavar soluciona parcialmente)
– Norequieren cationes divalentes (así
que EDTA no tiene efecto, a
diferencia de lo que pasa con
DNAsas)
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Manipulación del RNA
¿Cómo vencer a las RNasas?

Evitar la contaminación
con RNasas:

Impedir (o disminuir) la
acción de las RNasas:

- trabajar con material libre de

- utilizar inhibidores

RNasas (autoclavar soluciones,
material descartable especial,
etc.

específicos- trabajar con guantes en todo
momento

- trabajar con rapidez y
precisión y a veces en frío,
especialmente cuando no hay
inhibidores presentes
10

¿Dónde están las RNasas y cómo
luchamos contra ellas?
1.

2.
3.

4.

PROBLEMA
En uno. (Manos,
saliva, etc)
Tips, epps, etc.
Agua y buffers

Superficies del labo
(por presencia de
bact, hongos, céls
humanas, etc.)“SOLUCIÓN”
1. Guantes, trabajo prolijo

2. Todo RNasa-free
3. Agua mQ autoclavada, o
tratada con DEPC
(DISCUTIR)
4. Evitar contacto, limpiar
con soluciones
comerciales (ej RNase
zap de Ambion) o al
menos con alcohol
11

¿Dónde están las RNasas y cómo
luchamos contra ellas? (cont.)
5.
6.

7.

8.

PROBLEMA
RNasas endógenas

5.

Muestras RNA se
contaminan o las RNasascopurifican
Plásmidos que se usan
para transcripción in vitro

6.

Pipetas contaminadas con
RNasas

8.

7.

“SOLUCIÓN”
Frío (hielo, congelar en N2
líq) y rápido
Usar inhibidores de
RNasas (RNase-out de
Invitrogen, etc)
Si en la mini/maxi prep se
utilizó RNasa, usar
proteinasa K y extracción
con fenol cloroformo
Tener pipetas “para RNA”,
aspirar alcohol, usar tips
con filtro, etc.12

Purificación de RNA
• ¿Para qué sirve?
• ¿Cómo se trabaja con RNA?
• Pasos generales:
– Homogeneizar células
– Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
– Cuantificar el RNA purificado
– Calidad del RNA
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Purificación de RNA
• ¿Para qué sirve?
• ¿Cómo se trabaja con RNA?
• Pasos generales:
– Homogeneizar células
– Purificar el RNA (total o no total, ej mRNA)
–...