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Análisis del ciclo celular mediante técnicas inmunocitoquímicas para microscopía óptica
*Carbajo Pérez, E.; #Carbajo Pérez, S.; §Triviño, A.; *Hemández González, L. C.; *López Muñiz, A.
*Dept. Morfología y Biología Celular. Universidad de Oviedo. #Dept. Anatomía e Histología Humanas, Universidad de Salamanca. §Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Carmen y Severo Ochoa. Asturias.

1.-Introducción

La información acerca de la cinética celular supone una valiosa aportación a las distintas clasificaciones tumorales, basadas fundamentalmente en la apariencia microscópica (Almendral y col., 1992; García y col., 1989). Los distintos métodos de estudio para la evaluación de la proliferación celular permiten determinar con mejor exactitud la tasa de recambio celular en tejidos normaleso conocer el porvenir biológico de los tumores (Carey y col. 1992). Los estudios de proliferación celular estuvieron durante mucho tiempo restringidos al estudio de la división celular. Este era en un principio el único dato objetivable de la actividad proliferativa en los estudios de microscopía óptica. Se podía observar que una célula se dividía en dos células hijas repartiendo entre ellas elmaterial nuclear y el contenido citoplásmico. Los fenómenos previos a la división celular, necesarios para que la célula duplique su dotación genética, no se acompañan de modificaciones de la morfología celular, y por ello, estos fenómenos excedían los límites de las técnicas de microscopía convencional. El desarrollo de las técnicas de autorradiografía (ver Howard y Pele, 1951; Steel, 1977) hizoposible la identificación de las células en fase de síntesis de ADN. Si la timidina, precursor que es utilizado de forma exclusiva para la síntesis de ADN, se marca con un radioisótopo (generalmente tritio) y éste se administra bien in vivo o in vitro, las secuencias de ADN neoformado lo incorporarán, que135

dando marcadas con el radioisótopo. La energía emitida por estos radioisótopos marcarásu impronta en una película de emulsión fotográfica, permitiendo la identificación de las células que están en fase S. En la práctica, las técnicas de autorradiografía para el cálculo de la fracción de fase S son laboriosas, y se han visto en gran medida sustituídas por técnicas inmunocitoquímicas. El desarrollo por Gratzner (1982) de anticuerpos monoclonales frente a la bromodesoxiuridina (BrdU),un análogo de la timidina, ofrecía la posibilidad de identificar las células en fase S sin la necesidad de radioisótopos. De esta forma se obvia el principal inconveniente de las técnicas de autorradiografía, cual es la complejidad y lentitud en el procesado de las muestras. En los últimos años se han utilizado técnicas inmunocitoquímicas, no ya para detectar precursores de la síntesis de ADNincorporados por las células en fase S, sino para detectar antígenos nucleares que se engloban bajo el término genérico de antígenos nucleares de proliferación celular (PCNAs) dado que son estructuras antigénicas que no son observables en células en reposo. El estudio de estos antígenos se ha desarrollado fundamentalmente en el campo de la oncología, dado que su expresión es diferente, tantocuantitativa como cualitativamente, en células normales y malignas (Busch y Busch, 1977; Davis y col. 1978; Smetana y col. 1983). En el curso de los últimos años se han utilizado anticuerpos monoclonales frente a numerosas PCNAs. La rápida implantación de las técnicas para detectar PCNAs, tanto en los campos de la investigación clínica como básica ha venido de la mano de la gran simplicidad de las mismas.Aunque ha habido y hay serias discusiones acerca de la utilidad y fiabilidad de las mismas, sobre todo en el campo de la patología clínica, parecen ser técnicas con una gran proyección de futuro, que podrían simplicar en gran medida los estudios de cinética celular.

2.-Cuantificación de la fase S mediante marcaje con BrdU

La técnica de marcaje con BrdU está experimentando una rápida...