Celulas


LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502504
ESTUDIO CINÉTICO DE LA CATALASA
I. EL PROBLEMA
Verificar in vitro la cinética de la catalasa de hígado bovino y su relación con la concentración de sustrato.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
La catalasa es una enzima del sistema antioxidante que actúa sobre el peróxido de hidrógeno, presenta varias isoenzimas en diferentes tipos celulares, algunas siguen lacinética de Michaelis-Menten y otras no, a pesar de ser oligoméricas.
En la práctica se cuantificará la velocidad a la que se descompone una solución de H2O2 en oxígeno un proceso catalizado por la catalasa.
Para esto se calculará cuánto peróxido se consume después de varios intervalos de tiempo, deteniendo la reacción con ácido sulfúrico.
Con el propósito de medir la cantidad de peróxido restante,este se titulará con permanganato de potasio (KMnO4), que en presencia de H2O2 y H2SO4 reacciona así:
5H2O2+2KMnO4+3H2SO4   K2SO4+2MnSO4+8H2O+5O2
Note que el peróxido es el reactivo de esta reacción y al adicionarse en exceso durante una titulación, no se descompone y ocasiona que la solución tome un color rosa o café, la cantidad de permanganato adicionado es una medida proporcionala la cantidad de peróxido restante.
III. CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME
Elabore el preinforme, según lo pre-establecido y que contenga los resultados de la siguiente consulta máximo en dos páginas.
1. Sobre la catalasa en el enlace del aula virtual (DBGET Search – ENZYME) consulte y escriba en español: nombres comunes y sistemático, clasificación completa, incluyendo jerarquía (britehierarchy), reacción o reacciones que cataliza, sustrato, producto, cofactor y comentario sobre la enzima.
2. Describa en español brevemente la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria si la tiene, los aminoácidos del sitio activo y los grupos prostéticos, usando en todos los casos figuras impresas y recortadas del enlace del aula virtual - Enzyme structures database-. Para este propósitola búsqueda debe realizarla con el número de clasificación obtenido del primer enlace, en el espacio correspondiente a enzyme class: EC.

3. Realice un esquema del montaje general para hacer una titulación y describa brevemente los pasos básicos que se siguen en este procedimiento.
4. Explique cómo se puede medir la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente.
IV. MATERIALES YREACTIVOS
Reactivos generales
H2O2 1.5% (1000 mL)
H2SO4 1M (500 mL)
KMNO4 0.11M (1000 mL) VALORADO
Hielo

-Catalasa solución 1mg/mL (100mL) FRESCA: SE PREPARA ESE DÍA Y SE CONSERVA EN BAÑO DE HIELO
 Material por grupo de trabajo
1 frasco lavador
1 bureta de 25 mL
1 pinzas para bureta
1 gradilla
15 tubos de ensayo (pueden ser tapa rosca)
1 pipeteador
1 pipeta graduada de 1mL
1cronómetro
4 erlenmeyer de 250mL

V. PROCEDIMIENTO.
1. Realizar el montaje correspondiente a la titulación con una bureta que contiene permanganato de potasio (KMnO4).
2. Para determinar la cantidad de peróxido inicial presente en una solución al 1,5%, se deben realizar los siguientes pasos sin agregar la enzima, colocar en un Erlenmeyer 10 mL de peróxido de hidrógeno (H2O2), 10 mL de ácidosulfúrico y 1 mL de agua destilada, agitar bien; ubicar el erlenmeyer en el montaje de titulación, luego abrir la llave de la bureta y deja gotear su contenido, sobre el del erlenmeyer, con agitación constante y suave, hasta llegar al punto en el que todo el líquido en el erlenmeyer toma un color rosa muy pálido permanente. Anotar cuidadosamente el volumen de (KMnO4) consumido.
3. Enseguida se determinarála velocidad de descomposición del H202 presente en una solución al 1,5% luego de 2, 5, 8, 10, 20, 30, 60, 120, 180, 360, 420 y 480 segundos, parando la reacción con ácido sulfúrico.
Entonces para la medición correspondiente a 2 segundos colocar 10 mL de peróxido en un erlenmeyer limpio, enseguida adicionar 1mL de la solución de catalasa, agitar suavemente por 2 segundos cronometrados y...