Centrifugación analítica

Centrifugación analítica

Hasta ahora hemos visto que en los cálculos teóricos, los tiempos de centrifugación y el campo aplicados eran del orden de 4 segundos a 600 g para núcleos, por ejemplo, lo que es totalmente irreal, lo mínimo son 10 minutos y desde luego más de 600 g. esto implica que las ecuaciones teóricas halladas hasta el momento tienen sus limitaciones, que consistenprincipalmente en pasar por alto un efecto importantísimo. Recordemos que para postular la primera ecuación escogíamos un rotor flotante, pues bien, si escogemos ahora un rotor angular, vemos que la partícula no avanza suavemente hacia el final del tubo, sino que choca con la pared provocando una fuerza de rozamiento impresionante, tanto como para alargar los tiempos de centrifugación en 3 o cuatro ordenes demagnitud. El rotor flotante se presta más al engaño, pero también encaja si aplicamos al modelo las líneas de fuerza, de modo que las únicas partículas que no sufrirían esos choques serían aquellas que se encontraran en la misma vertical del de tubo.

Entonces, nos encontramos que nuestras ecuaciones presentan unas limitaciones, de modo que debemos encontrar otra forma de calcular S y eltiempo sedimentación, esta tecnología es la centrifugación analítica, y es empírica, necesita además una serie de requisitos:
• Que se aplique a sustancias lo más puras posible, no a grandes mezclas.
• Que presenten una mayor capacidad de giro, en torno a las 100.000 r.p.m.
• En cuanto al tipo de rotores, se necesita que las paredes del tubo se encuentren alineadas con las líneas de fuerza y esténprovistos de sistemas ópticos capaces de detectar la sedimentación de la partícula en cada momento.

Sistemas de detección

Como ya hemos dicho, la centrífuga lleva acoplado un sistema óptico, el cual se basa en un foco de luz, que atraviesa la cámara de carga, cuyas paredes son de cuarzo, y un detector al otro lado que recoge las variaciones de densidad óptica en un ordenador, proceso espermitido por la gran velocidad de giro, que prácticamente hace que la cámara de carga pase por el foco unas 2.000 veces o más por segundo. Esas variaciones hay varias formas de recogerlas, bien en gráficas c/x, que dan gráficas de tipo sigmoideo como el reflejado en el dibujo, donde la máxima pendiente nos indica el frente de sedimentación, o sea la línea que separa la zona del principio de lacámara donde ya no hay partícula debido a que esta ha empezado a sedimentar de la zona donde la concentración está aumentando con respecto a la distancia al fondo de la cámara. Otra forma de representar lo que ocurre gráficamente es la de medir la variación de concentración con la variación de distancia con respecto a la distancia, que forma un pico correspondiente al frente que por lógica es lamáxima variación de concentración frente a la distancia. Si en es segundo método mide variaciones de concentración frente a la distancia y hemos dicho que en la primera gráfica la máxima pendiente nos marca el frente, no hay que hacer un gran esfuerzo para pensar que si solapamos las dos gráficas el pico se corresponde con la máxima pendiente.
Hay varios métodos para medir la densidad óptica:
1.Ultravioleta: indicado para absorción especifica a esa longitud de onda (por ejemplo DNA). Da como resultado gráficas de tipo c/x.
2. Schlieren: mide variaciones del índice de refracción frente a la distancia (dn/dx), ya que n es proporcional a la concentración, la gráfica resultado es del tipo dc/dx.
3. Interferencia: al igual que el anterior da como resultado gráficas dc/dx, pero es mucho menossensible.
Estos métodos no son capaces de detectar pequeñas concentraciones de partícula, con lo que se deben trabajar a concentraciones del orden de 1 mg/ml para garantizar una buena detección, lo que conlleva un problema, y es que en muchos casos es muy complicado conseguir purificar una partícula a esa concentración.

Aplicaciones

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