Coomasiie

Un ensayo de proteinas en solucion se describe que depende de la conversión de azul brillante de Coomassie G250 en un acido diluido de un color marron-naranja a un color azul intenso. Tan pronto la solucion del colorante se mezcle con la muestra de proteinas, la absorbancia de la mezcla puede medirse. La absorbancia de la solucion es estable por 60-90 minutos a temperatura ambiente. La pruenapuede utilizarse con una variedad proteinas y polipéptidos con pesos moleculares superiores a 3000. El ensayo tiene unalata reproducibilidad y detecta hasta menos de 1ug de albumina. El unico reactivo requerido es muy estable, y los aminoácidos libres y varias sustancias quimicas que interfieren con el ensayo de proteinas Lowry no causa interferencia. La pruebas se adapta a un micrometodo, el cualse describe.

El uso del colorante azul brillante de Coomassie G250 para teñir proteínas en geles de poliacrilamida después de enfocar la electroforesis o isoeléctrico fue reportado por Reisner et al. (1). Su procedimiento elimina la necesidad de la decoloracion de los geles, ya que el colorante G250 esta libre en su forma leuco 3.5% de acido perclorico (PCA) tiene un color marron-naranja, perose convierte en un azul intenso cuando se une a la proteina. Basandose en estas observaciones, hemos demostrado que el ensayo para proteínas en solucion que implique el uso de concentraciones bajas de PCA o de otros acidos: proteinas permanecen solubles, y el colorante G250 queda en su forma leuco cuando no se una a la proteina.

METODOS
Reactivos y proteinas: Azul brillante Coomassie G250 fueobtenido de la compañía Eastman Kodak, Rochester. N. Y. ; algunos experimentos se realizaron con el colorante de Serva, Heidelberg. Lisozima de clara de huevo y ovoalbúmina, las 2 fueron cristalizadas 2 veces, fueron adquiridos de Aldrich Chemical Co. , Inc. , Milwaukee, Wis. Albumina plasmatica bovina (cristalino 5X) se obtuvo de Metrix, Chicago, III. Citocromo C del corazon de caballo (pureza90-100%) y fetuin (metodo de Spiro, pureza del 99%) se obtuvo de Grand Island Biological Co. , Grand Island, N. Y. Pepsina mucosa del estomago de porcino (2500 unidades/mg) se obtuvo de P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis. Inhibidor de tripsina de soya (cristalizado 5X) se obtuvo de Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio. cristales de insulina de sodio de carne de cerdo se obtuvieron deEli Lilly Co., Indianapolis, Ind. Inhibidor de tripsina pancreatica de bovino y péptido T31, un producto de la digestión con trpsina de la carboximetil del inhibidor (2), regalo del Dr. B. Kassell, The Medical College of Wisconsin, Milwaukee, Wis. Arginina-L-Hippural y el tripeptidos, glicilglicilclicina y glicilglicilfenilalanina, se obtuvieron de Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. DNA de timo decarnero y RNA se obtuvieron de Worthington Biochemical Corp., Freehold, N. J. El medio mínimo esencial del águila (MEM) en una solucion salina basal Earle fue adquirido en microbiological associates, Bethesda, md. MEM del aguila en una solucion salina basal de Hanks (HBSS) fue preparado por la adicion de aminoácidos esenciales de MEM y mezcla de vitaminas de MEM (que se obtiene deMicrobiological Associates) la solucion salina de Hanks fue preparado en nuestro laboratorio. El antiespumante B se obtuvo de Dow Corning Corp., Midland, Mich. Todos los demas productos quimicos fueron de grado reactivo o mejor.

Ensayo de proteinas: el ensayo estandar. El colorante Coomassie G250 fue preparado en una solucion de 0.06% cualquiera de estas: en 3% de PCA (w/v; 0.3M) o 2.2% de HCl (w/v; 0.6N) yse filtro en papel filtro Whitman No.1 para remover cualquier material sin disolver. Algunos grupos de colorante eran de un profundo color naranja en comparación con otros, si es necesario, las soluciones pueden diluirse en soluciones de PCA o soluciones de HCl para dar una absorvacia de 1.3-1.5 a 465nm, la maxima absorción de la forma leuco en el colorante.. soluciones a temperatura mabiente....