Creación de una Celula Bacterial

Se describe el diseño, la síntesis y ensamblaje de la 1,08-megabase par Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genoma a partir de la información digitalizada secuencia del genoma y su trasplante en una célula receptora M. capricolum para crear nuevas células de M. mycoides que están controlada sólo por el cromosoma sintético. El único ADN en las células es la secuencia de ADN sintética diseñada,incluyendo "marca de agua" y otras secuencias diseñadas supresiones de genes y polimorfismos y mutaciones adquiridas durante el proceso de construcción. Las nuevas células han esperado propiedades fenotípicas y son capaces de auto-replicación continua.
En 1977, Sanger y colaboradores determinaron la secuencia genética completa de fago φX174 (1), el genoma de ADN primero para ser secuenciadocompletamente. Dieciocho años más tarde, en 1995, nuestro equipo fue capaz de leer la primera secuencia genética completa de una bacteria auto-replicante, Haemophilus influenzae (2). Lectura de la secuencia genética de una amplia gama de especies ha aumentado de forma exponencial a partir de estos primeros estudios. La posibilidad de digitalizar rápidamente la información genómica se ha incrementado en másde ocho órdenes de magnitud en los últimos 25 años (3). Los esfuerzos por comprender toda esta nueva información genómica han dado lugar a numerosos nuevos paradigmas computacionales y experimentales, sin embargo, nuestro conocimiento genómico sigue siendo muy limitado. No existe un sistema único celular que tenga todos sus genes entendidos en términos de sus funciones biológicas.
Nuestrointerés en la síntesis de moléculas grandes de ADN y cromosomas surgió de nuestros esfuerzos durante los últimos 15 años para construir una célula mínima que contenga sólo los genes esenciales. Esta obra fue inaugurada en 1995, cuando se secuenció el genoma de Mycoplasma genitalium, una bacteria con la menor dotación de genes de cualquier organismo conocido capaz de un crecimiento independiente en ellaboratorio. Más de 100 de los 485 genes que codifican proteínas de M. genitalium son prescindibles cuando falla uno a la vez (4-6).

Se desarrolló una estrategia para el montaje de piezas de tamaño viral para producir moléculas grandes de ADN que nos permitió armar un genoma sintético M. genitalium en cuatro etapas a partir de cassettes de ADN sintetizados químicamente promedio de cerca de 6 kbde tamaño. Esto se logra mediante una combinación de métodos in vitro enzimáticos y recombinación in vivo en Saccharomyces cerevisiae. Todo el genoma sintético [582.970 pares de bases (pb)] se hizo crecer de forma estable como una levadura centromérica plásmido (YCp) (7).

Varios obstáculos se superaron en el trasplante de un cromosoma y expresando un cromosoma químicamente sintetizado en unacélula receptora. Teníamos que mejorar los métodos para la extracción de cromosomas intactos de la levadura. También es necesario para aprender a trasplante de estos genomas en una célula receptora bacteriana para establecer una célula controlada sólo por un genoma sintético. Debido a que M. genitalium tiene una tasa de crecimiento muy lento, recurrimos a dos especies de rápido crecimiento demicoplasmas, M. mycoides subespecie capri (GM12) como donante, y M. capricolum subespecie capricolum (CK) como receptor.

Para establecer las condiciones y procedimientos para trasplantar el genoma sintético de levadura, hemos desarrollado métodos de clonación de cromosomas bacterianos enteros como plásmidos centroméricos en la levadura, incluyendo un genoma nativo de M. mycoides (8, 9). Sin embargo,los primeros intentos para extraer el genoma de M. mycoides de la levadura y trasplantarlo en M. capricolum fallaron. Descubrimos que el donante y el receptor de micoplasmas comparten un sistema común de restricción. El genoma donante fue metilado en las células nativas de M. mycoides y fue por lo tanto protegido contra la restricción durante el trasplante de una célula donante nativa (10). Sin...