Cultivo In Vitro Casero

CULTIVO IN VITRO
CASERO
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OBJETIVOS
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Utilizar métodos básicos de cultivo in vitro y sus características.

FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento de plantas o partes de

plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se le debe
sumisnistra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua, nutriente,luz y agua. El agua y
los nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a través de las paredes de vidrio.
Es vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se mantengan
desinfectadas desde el principio del proceso de germinación. Cualquier bacteria u hongo que se
introduzca en los frascos crecerá más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hastamatarlas.
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MATERIAL
FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo).
Olla a presión.
Guantes.
Mascarilla de papel.
Espátula.
Bisturí.
Mechero de alcohol.
Soporte y rejilla.
Varilla de vidrio.
Pinzas metálicas.
Trapo.
Papel de aluminio (o papel film).
Gasa estéril.
Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas.

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Material de
Laboratorio

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Lejía.
Ácido clorhídrico.
Hidróxido sódico.
Lavajillas.
MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1
litro)
 100g de plátano maduro hecho puré o licuado
 10 g de agar-agar.
 15 g de azúcar.
 900 ml de agua destilada.
 1,2 g Tiamina *
Cápsula semillas orquídea u otra semilla.

Reactivos

Material biológico

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*4 comprimidos de algún remedio compuesto de Tiamina(vitamina B1) de 300 mg. Puede ser
substituido por complejos polivitamínicos (Teragram M o Supradyn).
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MÉTODO

a) Preparación de los frascos.
Se lavan bien los frascos y tapas con jabón y lejía. Se le quitan todos los restos
de etiquetas.
b) Preparación y esterilización del medio de cultivo.
1.

Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de plátano maduro hecho puré olicuado, 1 g
de azúcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se añaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. (lo
ideal es hacerlo en el microondas o en un hornillo con agitación continua para que el agar no se
estropee). Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plástico hasta disolver todos
los componentes.

2.

Mide el pH y ajústalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH paraincrementarlo). Debe de quedar
entre 5.5 y 6.

3.

Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos, para ello utiliza un embudo de
vidrio. Ten especial cuidado en que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de
los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminación por hongos y bacterias.

4.

Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de más omenos 1 centímetro (45 a
50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar más o menos 20 frascos.

c)

Esterilización del medio de cultivo

Los frascos se esterilizan en una olla a presión, la cual se puede considerar como un pequeño
autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material sometiéndolos a temperatura y presión
elevadas. Los pasos para la esterilización son los siguientes: Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para impedir así que los
frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor.
 Se añaden dos o tres centímetros de agua.
 Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la tapadera debe
quedar suelta o de lo contrario los botes acumularán presión y estallarán.
 Cerrar y calentar enun fogón a fuego fuerte hasta que la pesa comience a moverse y liberar
vapor o el medidor marque 15 PSI.
 Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave.
 Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y esté totalmente enfriada.
No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presión o temperatura hará que entre
aire “no estéril” a los frascos, creando un...