Determinacion De Hemoglobina

PRÁCTICA NO. 4

Determinación de Hemoglobina.
Objetivo: El alumno conocerá el método de cianometaheoglobina para la cuantificación de la hemoglobina, así como el cálculo e interpretación de resultados.

MATERIAL Y EQUIPO
 Charola
 Gradilla para tubos
 Tubos de ensaye
 Pipeta salí
 Boquilla de succión
 Pipeta graduada de 5ml
 Papel parafilm
 Mezclador de tubos
 Vaso deprecipitado
 Sistema vacutainer
 Torniquete
 Tubo vacutainer tapón lila (EDTA)
 Torundas
 Espectrofotómetro
 Celdas
 Solución valorada de cianometahemoglobina
 Reactivo de drabkin (cianometahemoglobina)
 Agua destilada
INTRODUCCIÓN

La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de O₂ y CO₂. Cuando está totalmente saturada, cada gramo contiene alrededor de1’4 g de O₂. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr de hemoglobina capaces de transportar 800ml de O₂.
En el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:
 HEMOGLOBINA A: consta de 2 cadenas α y dos cadenas β. En un adulto normal corresponde a más del 95% del total.

 HEMOGLOBINA A₂: consta de 2 cadenas α y dos cadenas β. En un adulto sano estáen proporción menor al 3%.

 HEMOGLOBINA F o fetal: consta de 2 cadenas α y dos cadenas β. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes de embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La HB F tiene mayor afinidad por el O₂.

 HEMOGLOBINA GOWER: consta de 2 cadenas α y dos cadenas β. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la HB F.

Laprincipal función de la hemoglobina es el transporte de O₂ de los pulmones donde la tensión es elevada hacia los tejidos donde es baja. A una tensión de O₂ de 100mmHg en los capilares pulmonares del 98% de Hemoglobina se combina con él O₂.
PROCEDIMIENTO
1) Obtener una muestra de sangre venos y agregarla a un tubo que contenga EDTA, mezclando para homogenización del anticoagulante y la muestra.2) Minutos antes de realizar la prueba, poner el tubo en un mezclador de tubos (de 2 a 3 minutos como minimo).





3) En un tubo de ensaye de 13x100 agregar 5 ml del reactivo de Drabkin y con ayuda de una pipeta Salí traspasar a este tubo 0.02 mL de sangre, tratar de agregar todo el contenido de la pipeta, enjuagando el capilar interno en el reactivo que tiene el tubo.4) Tapar el tubo con papel parafilm e invertir suavemente 4 veces.







5) Dejar reposar la mezcla por 10 minutos














6) Leer en el espectrofotómetro a 540 nm ajustando a cero de absorbancia con el reactivo de Drabkin.












7) Calcular la concentración de hemoglobina que está dada eng/dL con ayuda de una curva de calibración que previamente se debe realizar con el número de lote de reactivo con el cual se procesa la muestra.

8) En la curva de calibración se interpola la absorbancia de la muestra contra el eje de concentración.

9) En caso de no contar con una curva de calibración, utilizar la siguiente ecuación.




De donde CP= Concentración del problemaCS= Concentración del estándar
AP= Absorbancia del problema
AS= Absorbancia del estándar

VALORES DE REFERENCIA
Hombres 14.5 --- 17.5 g/dL
Mujeres 12.5 ----- 15.5 g/dL

10) Para realizar la curva de calibración se procederá de la siguiente manera.

Realizar diluciones estándar como se indica en la tabla siguiente. Leer a 540 nm en el espectrofotómetro ajustando acero de absorbancia con el reactivo de Drabkin. Graficar los resultados de absorbancia contra concentración en papel milimétrico.




Tubo Reactivo de Drabkin (mL) Estándar (ml) Concentración final (g/dL) Absorbancia
1 5 0 0 (blanco de reactivo) 0
2 4 1 4 0.140
3 3 2 5 0.253
4 2 3 12 0.369
5 1 4 16 0.475
6 0 5 20 0.605

Para calcular la concentración final del estándar en base a las...