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DIA 1 EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS


Introducción

Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sinembargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación.
En el caso particular del ARN, la gran abundancia y robustez de las ribonucleasas (enzimas que degradan específicamente ARN) celulares y de posibles contaminaciones ambientales, hace necesarios métodos y precaucionesespeciales. Estos incluyen la utilización de agentes fuertemente desnaturalizantes, o inhibidores específicos, que inactiven tales ribonucleasas. Debido a todo esto, en el práctico solo se realizarán purificaciones de ADN.
Las etapas del procedimiento que se utilizará en
• Desintegración del tejido y solubilización de los componentes celulares
• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución enun buffer adecuado

Homogenización de la muestra
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón(de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra.
Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos másutilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés.
Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se handescrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas , se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato desodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas.
La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas
Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como enotros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá,obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas y lípidos
Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato....