Guia De Laboratorio 2013

 CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos


TRABAJO PRÁCTICO


PURIFICACIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA INESPECÍFICA DE TUBÉRCULO DE PAPA (Solanum tuberosum) Y DETERMINACIÓN DE SUS PARÁMETROS CINÉTICOS.


INTRODUCCIÓN

Las enzimasfosfatasas hidrolizan monoésteres de fosfato en una reacción termodinámicamente favorable. (ΔGo’<-9KJ/mol-1). Son monómeros o dímeros de peso molecular aproximado a 50 ó 60 kDa. Se diferencian entre sí por su pH óptimo de catálisis (ácidas o alcalinas), PM, respuesta frente a distintos efectores, activadores e inhibidores. Se encuentran en una gran variedad de especies y tejidos.
En los seresvivos el anión ortofosfato (Pi) juega un rol vital en la transferencia de energía y en la regulación metabólica, siendo un importante constituyente estructural de muchas biomoléculas. Su acumulación a partir del medio ambiente, depósito y metabolismo son críticos para el desarrollo y crecimiento de todos los organismos, entre ellos los vegetales.
Durante este ciclo de trabajos prácticos sepurificará fosfatasa ácida de tubérculo de papa. Se caracterizará a la enzima purificada mediante determinación de su masa molecular, determinación de parámetros cinéticos (Km, Vmáx) y se observará el efecto de su inhibidor natural, el Pi.

Este trabajo práctico se desarrollará durante tres sesiones:
Sesión 1: Purificación de fosfatasa ácida: Etapas I y II
Espectros de pnitrofenol y proteínas
Sesión2: Purificación de fosfatasa ácida: Etapa III
Determinación de concentración de proteínas
Construcción de la tabla de purificación.
Sesión 3: Determinación de parámetros cinéticos.
Determinación de peso molecular.


MATERIALES

Buffer de extracción(BE):
acetato de sodio 50 mM pH 5,2
sal sódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM
fluoruro de fenil metilsulfonilo (PMSF)1 mM
β-mercaptoetanol (BME) 2 mM (agregar en el momento de usar)

Polietilénglicol (PEG) 50% (P/V)

Columna de intercambio aniónico QAE-Sepharose®

Buffer de columna (BC):
Tris HCl 50 mM pH 7,5
β-mercaptoetanol 1 mM (agregar en el momento de usar)
EDTA1 mM.

Citrato de sodio 200 mM pH 6,5

p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en pastillas conteniendo cada una 25 µmoles de reactivo.
a) 90 mM. Seprepara la solución con citrato de sodio 200 mM (pH= 6,5). Se utilizará como sustrato en las medidas de actividad enzimática que se realizarán para seguimiento de la purificación.
b) 50 mM. Se prepara la solución en medio acuoso. Se utilizará como sustrato en las medidas de actividad enzimática que se realizarán para medir los parámetros cinéticos de la enzima.


NaOH 500 mM

Fosfato de sodio 100mM

Reactivo de Comassie: Comassie Blue 6250 0.06 % en 3% P/V de ácido perclórico (concentración final 0,3 M) para medir concentración de proteínas. (Método de Bradford)


MÉTODOS

Determinación de actividad enzimática
Para la determinación de la actividad de fosfatasa ácida se utilizarán los métodos continuo y discontinuo. En ambos casos se empleará el sustrato artificial p-nitrofenil-fosfato(pNPP) que es hidrolizado según la siguiente reacción:




El p-nitrofenol absorbe a 405 nm. El coeficiente de extinción a pH=6,5 (pH de la determinación por método continuo) es 4400 M-1cm-1. .

Método discontinuo en placa: este método es cualitativo y permite comparar entre muestras con distintas actividades. Se realizará en un volumen final de reacción enzimática en cada pocillo de 200µl empleando pNPP 45 mM (pH=6,5) + H2O csp 170 µl. Iniciar la reacción con 30 µl de muestra y finalizarla luego de tres minutos con el agregado de 50 µl de NaOH 500 mM.

Método continuo: se realizará espectrofotométricamente a 405 nm en cubeta con un volumen final de 1000 µl,utilizando como buffer citrato 100 mM pH=6,5. La concentración de sustrato a emplear será a concentración saturante para...